[发明专利]一种NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，具体地说，涉及一种以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

急性肾损伤(AKI)是一种发病率和死亡率均较高的疾病，由于该病发病机理不明，并且缺乏准确可靠的早期诊断标志物，因此临床上尚未出现有效治疗药物。传统的肾损伤标志物(如血清肌酐、胱抑素C，α1微球蛋白、β2微球蛋白及视黄醇结合蛋白)多为功能性标志物，但绝大多数AKI的结构变化发生在功能性障碍之前，因此，结构性肾损伤标志物对AKI的诊断要更为敏感，其中研究最充分、变化幅度最显著的就是中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。

NGAL是一种小型且较隐秘的多肽，能直接从尿液中检测出来。大量研究证明，顺铂诱导AKI后约2h就能在尿中检测到NGAL，而检测出血肌酐的明显改变要3-4天。另外，儿童心脏手术后发生急性肾衰的患者在手术后2h的血、尿NGAL浓度明显升高，而血肌酐明显升高在1-3d后。由于测定血液中NGAL浓度既能避免因极度少尿带来的麻烦，又能减轻因使用利尿药进行治疗所带来的干扰，因此，其测定对AKI的早期诊断更加有力。总而言之，通过NGAL进行AKI的早期临床诊断，对提高AKI的治疗效果、降低死亡率具有重要价值。

目前对于NGAL的检测方法主要包括酶联免疫法(ELISA)、传统免疫比浊法、胶乳免疫比浊法等，其中，胶乳免疫比浊法通过将样本中的NGAL抗原与试剂盒中连接到胶乳颗粒上的特异性抗人NGAL抗体发生免疫反应，形成抗原抗体免疫复合物，使胶乳颗粒连接成网状，从而增加了反应溶液体系的浊度。浊度高低与NGAL抗原浓度在一定范围内呈正相关，通过测定特定波长(540nm-700nm)的反应溶液的吸光度，参照校准曲线即可计算出样本中NGAL的含量。相对于酶联免疫法来说，胶乳免疫比浊法通量大，耗时短，可实现自动化，并且可减少人为因素对检测结果的影响；而与传统的免疫比浊法相比，使用胶乳颗粒可增加试剂的灵敏度及准确度；因此，胶乳免疫比浊法具有较好的应用前景。

然而，根据健康人群体检数据，尿液中NGAL含量一般在10ng/mL以下，而根据文献记录，发生急性肾损伤时尿液中的NGAL可达几千甚至上万ng/mL，所以需要在保证试剂线性范围的基础上，增加试剂的灵敏度，否则临床检验时需要稀释样本才能保证高浓度NGAL的测试准确性，使用非常不便。

另外，丹麦BIOPORTO公司是世界上最早研究NGAL诊断试剂的公司，其NGAL ELISA及胶乳免疫比浊法检测试剂在临床上的应用已获得世界范围内的认可。而国内现有自产的NGAL试剂与BIOPORTO公司生产的检测试剂的相关性均偏低，极大地限制了国产试剂在临床上的应用。

因此，亟待在常规的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备基础上进行改良，以提高NGAL胶乳免疫比浊法试剂的灵敏度及准确度，改善试剂的稳定性。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明提供了一种以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，以改善胶乳免疫比浊法检测试剂的灵敏度、特异性以及抗体结合胶乳颗粒的稳定性。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中，所述试剂R2包括抗体、胶乳颗粒和R2缓冲液，其特征在于：所述试剂R2制备过程中所使用的封闭剂为聚乙二醇六氨，聚乙二醇六氨的化学结构式为H-(O-CH₂-CH₂)n-(NH)₅-NH₂。

所述试剂R1包括胶乳免疫比浊法检测试剂盒常规使用的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等，其使用浓度为10-250mM。

试剂R1还可包括常规的电解质、表面活性剂、非特异性反应阻断剂、促凝剂、防腐剂、生物稳定剂等成分。

进一步地，非特异性反应阻断剂可选用抗HAMA抗体，抗RF抗体、羊血清、鼠血清或兔血清等。

所述抗体为特异性抗人NGAL抗体，可选用单克隆抗体或多克隆抗体。

优选地，所述抗体为鼠抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体中的任意一种。

优选地，所述胶乳颗粒粒径为100-400nm，表面电荷为0.05-0.2mmol/g。