[发明专利]一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor‑2，HER‑2)的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测HER‑2的引物及探针能特异地扩增并检测HER‑2基因的扩增。本发明还公开了一种基于微滴式数字PCR系统的检测HER‑2基因的检测试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测HER‑2基因的扩增。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床HER‑2基因扩增的快速检测，为临床人表皮生长因子受体2的诊断和治疗提供参考依据。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核苷酸序列、试剂盒及其应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因位于染色体17q12-q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720-987位属于酪氨酸激酶区。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员，与EGFR高度同源。研究证实，HER-2介导的信号传导与多种肿瘤的形成、增殖、转移、侵袭及放化疗耐药有关。以往其相关研究多集中于乳腺癌和卵巢癌。近年的研究显示，HER-2在胃癌中也存在高表达，有望成为一个新的基因治疗靶点。

原瘤基因HER-2/neu的研究是当前研究的热点之一。目前女性乳腺癌中,有25％～30％的病人有这种基因扩增。文献报道15％～20％的浸润性乳腺癌和多达60％的导管原位癌有HER-2/neu基因和蛋白的表达。大规模研究证实HER-2阳性的肿瘤不仅其预后较差，而且复发的风险显著增加，主要表现在基因扩增与乳腺癌的复发、转移有关。近年来，随着医疗技术的进步，以HER-2为靶点的靶向治疗药物——曲妥珠单抗(罗氏制药，中文商品名：赫赛汀)。该药物通过抑制细胞活化信号的传递,用于治疗HER-2高表达的乳腺癌患者，不仅显著减少了肿瘤的转移和复发率，也提高了患者的生存质量。随机对照临床研究已证实，抗HER-2单克隆抗体曲妥珠单抗联合化疗在HER-2过表达晚期胃癌中的疗效显著优于单纯化疗。赫赛汀以HER-2为治疗靶点，若要筛选可受益于赫赛汀治疗的患者，必须进行HER-2基因检测。对于乳腺癌的治疗和预后均具有重要意义。

目前，临床上检测HER-2状态的常用方法有免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)。IHC是基于抗体在蛋白(基因产物)水平上检测HER-2的状态，该法易于开展，已被广泛使用，但技术本身受组织固定、抗原修复、一抗的灵敏度和特异度、染色结果评定等多种变量的影响，使得结果不够准确和稳定，尤其对HER-2轻、中度表达的样本易产生假阴性。FISH是基于探针直接在DNA(基因)水平上检测HER-2的状态，该法灵敏、准确、可靠，结果具有高度的可重复性。但FISH依赖于制作的探针质量和样本前期制片质量，同时还受17号染色体多倍体干扰，且检测流程长，操作复杂，结果分析困难，技术难度和成本均较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型HER-2基因扩增检测试剂盒，满足临床HER-2诊疗需求。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于特异检测HER-2基因扩增的引物和探针，具体包括如下：

(1)扩增HER-2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增HER-2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)扩增21-TFF3-S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；