[发明专利]体液样本中稀有肿瘤细胞的检测分型方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种对体液样本中高代谢活性稀有肿瘤细胞的检测分型方法，包括如下步骤：将体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的第一代谢标志物和第二代谢标志物共同孵育；通过高通量成像检测所有细胞所摄取代谢标志物的荧光信号，从而确定所述细胞的能量代谢方式与强度；根据代谢标志物组合的荧光信号鉴定体液样本中具有高代谢活性的肿瘤细胞并进行分型。本发明还提供了用于上述检测分型的试剂盒，包括微孔阵列芯片；能够产生荧光信号的第一代谢标志物和第二代谢标志物；针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体。本发明基于荧光信号特征来鉴定与分型体液样本中的稀有肿瘤细胞的能量代谢方式，操作简单快速，大大降低了损失稀有肿瘤细胞的可能。

技术领域

本发明涉及对癌症患者体液(如血液、胸水、腹水、脑脊液等)样本中高代谢活性的稀有肿瘤细胞进行基于能量代谢方式的功能分型的方法。本发明还涉及用于癌症患者体液样本中高代谢活性稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。因此，在这些体液样本中找到肿瘤细胞是判定肿瘤存在、甚至转移的可视化的、高级别的证据，具有明确的临床意义。但是，这些体液样本中的肿瘤细胞不但数量稀少，而且往往具有异质性，这种异质性不但表现在基因组、转录组层面，更明显的表现在功能层面。比如，癌症转移是一个低效的过程，只有极少数播散进入体液的肿瘤细胞能够最终成功形成转移灶，大部分肿瘤细胞在体液中由于失巢凋亡而不再具有活性及转移能力。因此，即使这些肿瘤细胞在基因组层面上没有明显区别，但显然在功能层面上并不相同，而这种功能上的不同直接影响转移是否成功以及患者的临床结局。癌症临床研究的一个重要课题就是发现能够引起远处转移的肿瘤细胞子群，这些肿瘤细胞能够在血液、胸水、脑脊液等体液中存活下来并能够有效的形成远处转移，因此对体液中的稀有肿瘤细胞进行功能评估并进一步分型至关重要，而分型的目的在于研究具有不同功能特征的肿瘤细胞子群的恶性程度与转移潜能，并进一步据此来对患者进行预后判断。

在复杂的生物液体样本中鉴定稀有肿瘤细胞并进行功能评估是非常具有挑战的工作。肿瘤细胞稀有意味着须采用具有单细胞精度的检测方法。目前在体液样本中鉴定脱落肿瘤细胞主要依赖于细胞学检查，基于肿瘤细胞的形态学特征进行鉴定，并进一步结合免疫组化明确其器官来源和病理分型，费时费力且有较高的专业要求。美国麻省理工学院的Robert A.Weinberg教授在2011年总结了肿瘤细胞的十大基本特征(Hallmarks ofCancer:The Next Generation,Cell,2011,144,646)，包括维持增殖信号，逃避生长抑制，抑制细胞死亡，无限自我复制，诱导血管生成，激活浸润转移，避免免疫损伤，促进肿瘤炎症，能量代谢异常以及基因组不稳定等。这些基本特征能够有效地鉴别恶性细胞，但大部分与功能相关，其中除了“能量代谢异常”这一特征以外，其他特征均难以方便地在单细胞尺度上进行高通量的检测。

肿瘤细胞具有不同于正常细胞的能量代谢途径，这一现象首先被OttoWarburg观察到。Waruburg发现，即使在氧气存在的情况下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解的方式进行能量代谢，其摄取的葡萄糖大大高于正常细胞，这一效应被称为Warburg效应，Warburg也因此获得1931年的诺贝尔奖。Warburg效应在临床上已有广泛应用，通过将带有放射性标记的葡萄糖类似物(¹⁸F-FDG，即2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖，简称FDG)作为示踪剂，应用正电子发射断层摄影术(PET/CT)可以非侵袭性、可视化灵敏检测体内高葡萄糖摄取的恶性组织，从而发现肿瘤原位及转移病灶。在体外检测中，同样可以用该放射性标记的葡萄糖类似物来鉴定恶性肿瘤细胞，同时也可以用荧光标记的葡萄糖类似物进行检测。进一步的研究发现，肿瘤细胞存在多种营养物质来源，除了葡萄糖以外，还对谷氨酰胺也特别上瘾，因此可以通过不同的代谢标志物来检测肿瘤细胞的不同代谢方式。

因此，如何实现对大量细胞的高通量检测，并通过检测体液样本中所有细胞的能量代谢情况来鉴定其中稀有的肿瘤细胞，尤其是进一步根据其代谢方式对这些肿瘤细胞进行分型，具有十分重要的理论和现实意义。

发明内容