[发明专利]单分子水平观测气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法

权利要求书

1.一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，包括以下步骤：

A步骤、将目的蛋白的基因插入到表达载体中，与编码荧光标记蛋白的基因融合，通过农杆菌侵染得到转基因植株，在所述转基因植株中实现对目的蛋白的荧光标记；以转基因植株拟南芥种子置于滤纸上，将85％乙醇和H ₂O ₂配比为3：1的消毒液洒到拟南芥种子上，待种子表面的消毒液干后，将所述种子播种于含1/2Murashige-skoog固体培养基上；将培养皿放于4℃冰箱进行春化，春化24h后拿出，置于智能光照培养箱中进行培养，培养温度为22℃，光照条件为16小时光照和8小时暗培养循环；在载波片上滴加培养基溶液，将拟南芥幼苗置于载玻片上，然后加盖普通盖玻片；盖玻片与载玻片之间充满溶液但无气泡；

B步骤、使用100X、数值孔径为1.45的镜头，滴加镜油，调节488nm激光入射角度数值为1.325，调节激光强度到物镜出口激光强度为1mW；在此物理条件下，曝光时间为100ms，电子增益为300，用20Hz频率对样品进行时间序列成像，每两帧图像之间时间间隔为0，获得连续的时间序列图像200帧；激发光的激发波长为488nm，收集波长为525nm；设定曝光时间100ms，EM Gain为300倍，频率20Hz对样品进行连续成像；

C步骤、对所获得的时间序列图像进行Subtract Background处理；

D步骤、对所获得的时间序列图像进行单颗粒追踪，应用软件Matlab R2014a，获得每个时间点的图像中每个荧光点的坐标信息以及荧光强度信息，综合时间和荧光点坐标信息，计算目的蛋白的运动轨迹；通过连续追踪荧光信号，保卫细胞膜蛋白在膜上呈现高度动态，不断地出现和消失，取停留大于2帧的荧光点用于进行膜上停留时间分析；

E步骤、综合时间和荧光强度信息，对目的蛋白的停留时间动态进行分析；从荧光分子在焦平面上出现到完全消失，所持续的帧数，与曝光时间和拍摄时间间隔进行相应的换算，计算出荧光分子的停留时间；

F步骤、对气孔保卫细胞膜蛋白停留时间进行高斯拟合。

2.根据权利要求1所述的一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，其特征在于：所述A步骤中首先通过聚合酶连锁反应扩增目的基因，通过双酶切、连接的手段将目的基因插入到表达载体pCAMBIA 2300中，最后通过农杆菌侵染得到具有荧光标签的转基因材料。

3.根据权利要求1所述的一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，其特征在于：所述A步骤中目的蛋白为植物保卫细胞膜上表达的功能蛋白，所用载体为植物双元表达载体，种植转基因植株的培养皿需要直立放置，使植物根完全垂直地面生长，便于全内反射荧光显微镜观察。

4.根据权利要求1所述的一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，其特征在于：所述A步骤中在载波片上滴加50μL1/2Murashige-skoog培养基溶液，将生长3-5天的转基因材料幼苗置于载玻片上，将叶片远轴面贴近载玻片；所述载玻片的折射率为1.52。

5.根据权利要求1或4所述的一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，其特征在于：所述C步骤中，对由所述B步骤所得到的图像运用小波变换算法处理进行背景去除，通过计算荧光点周围3×3个像素的局部极大值得到亚像素精确值，计算出荧光点的权重重心而确定荧光点的位置；借助Image J 1.48进行蛋白分布的分析；在ImageJ软件中打开绿色通道图像，选择“process-Subtract Background-”设置“RollingBall Radius”设置为“25Pixels”；运行“Image-Adjust-Brightness/Contrast”，调整图像的亮度和对比度，设置“JPEG Quality”为“100”，然后将图像均另存为TIFF格式。