[发明专利]单分子水平观测气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法

说明书

单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：A、获得荧光标记目的基因的转基因材料；B、以全内反射荧光显微镜获取保卫细胞膜蛋白的实时影像；C、通过Image J软件将所得时间序列图像进行处理；D、通过Matlab R2014a对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，确定单个蛋白聚合体的动态；E、计算气孔保卫细胞膜蛋白在细胞质膜上的停留时间；F、对目的蛋白的停留时间参数进行高斯拟合，确定目的蛋白的停留时间及变化。此方法具有提高成像的信噪比，可进行高分辨率的观测，成像速度快，活体可视化及可重复性高的优点。本发明在植物基因功能研究中具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法。

背景技术

气孔是植物与外界环境进行气体和水分交换的门户，控制着光合作用吸收CO₂、水分蒸发，在植物的生命活动中具有重要作用。形成气孔的保卫细胞通过感知环境刺激，调控气孔的关闭与开合。特别是在气孔保卫细胞膜上定位的蛋白，在感受外界环境以及调控气孔应答生物和非生物胁迫中具有重要功能。然而，以往对保卫细胞中蛋白的研究，主要是利用光学显微镜在突变体等遗传材料中对植物气孔开度进行测量。这种方法仅是把气孔作为一个整体进行研究，不能对保卫细胞膜蛋白进行直接分析。特别是，不能对感受刺激后保卫细胞膜蛋白的动态特征进行实时检测分析。

已有研究报道，细胞膜是一个非均相的高度动态的生物学体系，因此质膜蛋白的时空动态必然与很多基础细胞学过程密切相关。但是，植物的保卫细胞存在细胞壁厚、自发荧光强，容易对最终数据产生干扰，以及长时间照射造成的细胞光损害和光漂白等都可能会对分子动力学的测量产生影响。特别是保卫细胞与叶表皮细胞不在同一平面，导致成像困难。

现有技术中缺少一种实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布的方法，尤其缺少一种高分辨率并且能够快速对气孔保卫细胞膜蛋白分布进行动态观测的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，尤其是提供一种高分辨率实时观测气孔保卫细胞膜上蛋白分布、运动和停留时间的方法。

具体包括以下步骤：

(1)获得带有荧光标签的转基因植株；

(2)用全内反射荧光显微镜，选择标记荧光蛋白所对应波长的激发光对由步骤(1)所得转基因植株进行观察，调整激光入射角度，在细胞壁与细胞膜之间发生全内反射，并获得时间序列图像；

(3)应用Image J 1.48软件对步骤(2)获取的时间序列图像进行处理，获得影像信息，进行目的蛋白分布分析；

(4)应用Matlab 2014a(The Mathworks)对步骤(2)获取的时间序列图像中的荧光信号进行单颗粒追踪，分析蛋白运动轨迹；

(5)根据步骤(2)获取的时间序列图像，应用Image J 1.48分析荧光点的荧光强度，记录从荧光信号出现到完全消失所持续的帧数，与曝光时间和拍摄时间间隔进行相应的换算，计算出荧光分子在焦平面上的存在时长(lifetime)，从而获得目的蛋白在细胞质膜上的停留时间(dwell time)的，以及从细胞质膜上解离的程度；

(6)对气孔保卫细胞膜蛋白停留时间进行高斯拟合。

进一步，所述步骤(1)中，首先通过聚合酶连锁反应(Polymerase chainreaction，PCR)扩增待测蛋白的基因，通过双酶切、连接的手段将目的蛋白的基因插入到表达载体pCM2300中，与编码荧光标记蛋白的基因融合，最后通过农杆菌侵染得到转基因植株，从而在所述转基因植株中实现对目的蛋白的荧光标记。所述目的基因为植物气孔保卫细胞膜上表达的基因，所用载体为植物双元表达载体。