[发明专利]简并引物及利用该引物克隆植物中抗病虫害蛋白基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗农业病虫害植物分子领域，特别涉及利用通用简并引物大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因。

背景技术

通过对兰科、百合科、天南星科和石蒜科植物海芋、风雨花、朱顶兰、玉莲、黄花石蒜、大蒜、葱、脉羊耳兰、黄精等的研究表明，在其植物体内，含有丰富的能特异结合甘露糖的蛋白质，并且，这些能特异结合甘露糖的蛋白质对农作物害虫及病害具有显著的抑制效果。这为转基因作物抗农业病虫害的研究和生产提供了新的候选基因资源。面对一个具有抗农业病虫害活性的巨大的候选基因资源群体，通常，多是通过设计特异性的引物，克隆其中的一个基因，经基因工程的方式应用到转基因农作物中。而找到植物中甘露糖结合蛋白家族基因的简并引物，能有效地大规模克隆此类目的基因，并且对研究未被报道的该蛋白家族基因提供有力的引导。目前，还未出现与之相关的简并引物设计及序列的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一对植物中具有抗农业病虫害的甘露糖结合蛋白质的基因家族的简并引物，用以大规模克隆该类基因家族成员，为抗农业病虫害转基因农业研究和生产提供丰富的候选基因资源。

本发明所述的简并引物设计，是利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，以“mannose-binding lectin”为检索词，进行“Nucleotide”检索，得到植物中甘露糖结合蛋白质的基因的所有记录条目，进入“Zephyranthes candida lectin mRNA,complete cds”条目，接着进入其指向的蛋白记录页面

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/20531731)。

在上述的蛋白记录页面，进行“RunBlast”，将所有100条已记录的氨基酸序列进行多序列比对，从而发现这些植物中甘露糖结合蛋白序列中的保守氨基酸序列，比对结果见

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi。

选择这些蛋白质中的一条氨基酸序列，至引物设计软件Primer Premier5中，先将其翻译为核苷酸序列，由于密码子的简并性，得到一条具有简并性的核苷酸链，据此，将比对结果中的植物甘露糖结合蛋白的保守区域包含在这条简并性核苷酸序列之内，设计合适的简并引物对。

这对简并引物的序列是：

上游引物：5’-AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC-3’；

下游引物：5’-RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT-3’。

简并引物中：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，N＝A/T/G/C。

我们还提供了一种大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因的方法，该方法包括以下步骤：利用上述一对简并引物对单子叶植物甘露糖结合蛋白基因的保守序列进行PCR反应，然后以此PCR产物为反应模板，利用3’，5’RACE的方法，对该单子叶植物甘露糖结合蛋白基因序列进行PCR反应，最终克隆到目的基因。

所述单子叶植物包括但不局限于兰科(Orchidaceae)、百合科(Liliaceae)、天南星科(Araceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)植物。

进一步的，所述农业病虫害包括：刺吸式口器害虫中的棉蚜、麦蚜、桃蚜蚜虫、褐飞虱、叶蝉及鳞翅目害虫；以及水稻稻瘟病、纹枯病、小麦赤霉病。

本发明提供了植物中具有抗农业病虫害生物活性的甘露糖结合蛋白的基因的简并引物，可用于大规模克隆该家族中基因，为其更广泛应用于抗农业病虫害转基因农业的研究实践提供基础，并且对还未被发现的该家族蛋白成员的研究提供支持。

具体实施方式

实施例一：玉帘(Zephyranthes candida(Lindl.))和一叶兰(Aspidistra elatior Blume)植物中甘露糖结合蛋白的基因克隆

实施例1：玉帘、一叶兰中总RNA提取、质量检测及反转录

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料：玉帘和一叶兰植物分别采集自中国四川峨眉山及屏山，冷冻保存于-80℃备用。