[发明专利]细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

权利要求书

1.一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于采用微流控芯片，按照以下步骤进行：

（1）明胶甲基丙烯酰胺材料的合成：将明胶溶于 DPBS溶液，然后加入甲基丙烯酸酐溶液，之后加入DPBS溶液来终止反应；随后用去离子水透析，接着将透析液过滤，最后将滤液冻干数天从而得到多孔的明胶甲基丙烯酰胺材料；

（2）明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核/壳内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤（1）中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口（3）通入到核流体通道（7）中；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺混合液，通过微流控芯片的壳流体入口（2）通入到壳流体通道（6）中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道（8）中形成稳定的层流；

再由连续相入口（1）通入的含 span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处（4）经过紫外光固化，即形成含有负载了细胞的固化的壳及负载了细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小；

（3）细胞3D单独/分区共培养：经过上述步骤制备的核/壳内负载细胞的微球可以经过离心收集，离心速率300-800 rpm，1-3 min，后直接转移到培养基中进行3D单独/分区培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征; 该微流控芯片主要由连续相入口（1）、壳流体入口（2）、核流体入口（3）、微球出口（4）、连续相通道（5）、壳流体通道（6）、核流体通道（7）、层流通道（8）及主通道（9）组成；连续相入口（1）通过连续相通道（5）与主通道（9）连接，壳流体入口（2）、核流体入口（3）分别通过壳流体通道（6）、核流体通道（7）与层流通道（8）及主通道（9）连接; 连续相通道（5）、壳流体通道（6）、核流体通道（7）、层流通道（8）、主通道（9）宽度范围均为100-500 μm，芯片各部分通道高度范围为50-400 μm，主通道（9）长1-2 cm，层流通道（8）长范围为0.5-1.5 mm。

2.按照权利要求1所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法， 其特征在于：所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片；PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理；所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5%-5%。

3.按照权利要求1所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄ 0.2g溶于1L蒸馏水中。

4.按照权利要求1所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）所述明胶的浓度为0.01~0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5%-10%，明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5 mL/min。

5.按照权利要求1所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）透析时间为1-10天，过滤器孔径为0.22-8 μm，冻干天数为1-10天。