[发明专利]细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

说明书

本发明提供了一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。该方法主要包括以下步骤：明胶甲基丙烯酰胺材料的合成、明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核/壳内细胞负载、细胞3D单独/分区共培养等。本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D区域化培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

技术领域

本发明涉及材料化学与微流控技术领域，具体涉及一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。。

背景技术

体外构建功能化的组织模型在组织工程、再生医学、伤口愈合、药物筛分等领域已被广泛关注。在体内，功能化组织涉及多种类型的细胞以及细胞与细胞外基质间的相互作用。此外，在体外构建功能化组织中，细胞外基质也提供了3D支架材料用于区域化培养不同种类的细胞。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架材料，已经在细胞分区化培养、体内微组织模型构建、血管形成、组织块移植等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术(图案化、纺丝等)所得到的细胞3D培养水凝胶组织块，存在不可控、不均一、营养物质交换能力差等缺点，这就需要提出一种可控水凝胶支架材料的制备方法。而微流控技术的提出，正好能弥补这些不足，逐渐在体外3D组织构建中得到应用。

当前，利用微流控技术制备的细胞3D培养体系主要是实心微球的制备，而实心微球用于细胞3D培养存在流体剪切力对细胞的损伤、细胞在微球内生长的不可控、多种细胞不能区域化培养等缺点，不能更真实的模拟人体内多种细胞间的相互作用，所以核壳区域化微球的构建解决了以上问题。目前，用于细胞核壳区域化培养的方法主要是分步负载，即先制备负载细胞的实心微球，再将另一种细胞悬液与微球混合使得第二种细胞粘附在微球表面，从而将不同种类的细胞区域化培养，其本质还是基于实心微球的构建，操作还比较繁琐。本发明提出一步法制备核壳微球并用于细胞3D分区化培养，也就是说在形成微球的同时可完成核壳分区化细胞的负载。

明胶材料，几十年来成为科研工作者关注的对象。由于其具有独特的优势，比如，明胶包含许多能促进细胞粘附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列；含有适合细胞重新构造的基质金属蛋白酶(MMP)序列；含有很多氨基、羧基、羟基，故可用于修饰嫁接官能团。且由于其低温呈现固态、高温呈现液态的性质，在用于细胞3D培养中需要将其固化从而形成稳定的支架材料。如在明胶用甲基丙烯酸酐修饰后在光引发剂存在的条件下，紫外条照射发生自由基聚合反应，从而将明胶固化，即形成明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料。目前，采用明胶甲基丙烯酰胺材料制备的微球主要是实心微球，形式单一、不能区域化，而本发明结合生物相容性极好的明胶甲基丙烯酰胺材料，一步法制备核壳微球能解决细胞区域化培养问题，且体系稳定、操作简单。

发明内容

本发明提供了一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，致力于发展生物相容性很好的且用于细胞3D分区单独/共培养的水凝胶材料的方法。

本发明一种微流控芯片，主要由连续相入口、壳流体入口、核流体入口、微球出口、连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道及主通道组成，连续相入口通过连续相通道与主通道连接，壳流体入口、核流体入口分别通过壳流体通道、核流体通道均与层流通道及主通道连接。

所述的微流控芯片，连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道、主通道宽度范围均为100-500μm，芯片各部分通道高度范围为50-400μm，主通道长1-2cm，层流通道长范围为0.5-1.5mm。

一种微流控芯片的制备方法，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5％-5％。

本发明一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述微流控芯片，具体包括下列步骤：