[发明专利]DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法

说明书

本发明涉及DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法。该DNA分子RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的RBS1能够提高脯氨酸羟化酶编码基因表达。

技术领域

本发明总地涉及氨基酸发酵领域，具体涉及DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸，又称羟脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，Hyp)是一种亚氨基酸，为L-脯氨酸经过羟基化得到的产物。羟脯氨酸大量存在于胶原中，也存在于弹性蛋白、牙齿珐琅、补体C1和伸展蛋白中。作为一种稀有亚氨基酸，羟脯氨酸在医药、化工、食品和美容等行业都具有广泛的应用。在医药领域，羟脯氨酸可以作为消炎药、碳青霉烯类等化学药物的合成前体，其衍生物N-乙酰-反式-4-羟脯氨酸是无毒副作用的炎症治疗药物奥沙西罗的有效成分，可以有效治疗结缔组织疾病，如骨关节炎等。在化工合成方面，羟脯氨酸是合成多种聚合物的必不可少的手性原料，还可以作为一种手性合成元件，用来合成聚酯碳酸、N-烷基吡咯、N-芳香基吡咯以及生物碱TAN1251A等具有高附加值的产品。在食品方面，由于羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料风味，可以作为增味剂和营养增强剂。在美容方面，羟脯氨酸具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因此许多化妆品中都添加有羟脯氨酸，以保养皮肤和延缓衰老。羟脯氨酸衍生物还具有保湿功能，日本协和发酵公司研究发现，羟脯氨酸的衍生物N-乙酰羟脯氨酸能有效地维持表皮细胞水分，在化妆品中添加N-乙酰羟脯氨酸可锁水保湿，使皮肤保持弹性。随着对其研究的不断深入，羟脯氨酸及其衍生物的应用范围也将进一步扩大。因此，羟脯氨酸具有非常广泛的应用前景。

目前，羟脯氨酸的生产方法主要有提取法和微生物转化法。然而，常用的生物提取法需经过强酸强碱处理，纯化工艺复杂，提取收率低，生产成本高，且废弃物污染严重。随着环境压力的增加和资源原料成本的上升，传统的生物提取法逐渐被市场淘汰。微生物转化法即利用酶的立体专一性反应，以发酵法或者催化法生产目标产物。反应多在常温常压的细胞内或者细胞外下进行，可高选择性地制备所需的产物。因发酵法较催化法具有底物选择性广、成本低等优点，所以利用微生物发酵法合成羟脯氨酸并将其产业化具有现实意义。

目前对于羟脯胺酸微生物转化法生产的研究报道较少，研究人员根据密码子的简并性与大肠杆菌对密码子的偏好性，优化脯氨酸4-羟化酶基因(DSp4h)在大肠杆菌的表达；敲除putA基因，以阻断脯氨酸向谷氨酸的降解途径；引入vgb基因，解决菌株发酵过程中的溶氧过低的问题，进一步提高羟脯胺酸的发酵产量。但目前以葡萄糖为底物发酵生产羟脯氨酸的产量仍然较低(25g/L，96h)，与实现工业化生产存在较大差距，因此，亟需选育高效合成羟脯氨酸的工程菌株，实现羟脯胺酸的微生物直接发酵法生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA分子，包含该DNA分子的表达载体和重组菌，重组菌的构建方法以及羟脯氨酸的制备方法。

本发明提供了一种DNA分子RBS1，其中，所述RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述RBS1能够调控脯氨酸4-羟化酶编码基因(DSp4h)的表达。

本发明还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体含有脯氨酸4-羟化酶编码基因和位于其上游的前述RBS1。所述RBS1用于调控脯氨酸4-羟化酶编码基因的表达。