[发明专利]一种APN基因敲除的IPEC-J2细胞的构建方法在审
| 申请号： | 201711170105.1 | 申请日： | 2017-11-22 |
| 公开（公告）号： | CN108220338A | 公开（公告）日： | 2018-06-29 |
| 发明（设计）人： | 包文斌;戴开宇;王诗琴;王海飞;吴圣龙 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66 |
| 代理公司： | 扬州市锦江专利事务所 32106 | 代理人： | 江平 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因敲除 构建 基因工程技术 细胞系基因组 小肠上皮细胞 细胞 基因序列 抗腹泻病 应用提供 致病机制 转基因猪 病原体 敲除 腹泻 培育 研究 | ||
1.一种APN基因敲除的IPEC_J2细胞的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将5’端添加CACCG的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列退火形成双链DNA；
2）将双链DNA与线性化后的敲除载体pGK1.1连接，得到连接产物；
3）以引物：
F：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’
R：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’
对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，取得阳性打靶载体；
4）将阳性打靶载体转染猪小肠上皮细胞，提取细胞基因组DNA，即得APN基因敲除的IPEC-J2细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤1）中，将5’端添加CACCG的sgRNA序列和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列和双蒸水、退火缓冲液混合，反应体系瞬时离心后，于95℃孵育3min，再经冷却获得双链DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤2）中，将双链DNA和线性化后的敲除载体pGK1.1、T4DNA连接酶、连接缓冲液、双蒸水混合后，体系瞬时离心后，于16℃孵育30min，取得连接产物。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于将所述连接产物加入Top10感受态，在无抗SOC液体培养基中进行扩大培养。
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