[发明专利]一种APN基因敲除的IPEC-J2细胞的构建方法

说明书

一种APN基因敲除的IPEC_J2细胞的构建方法，属于基因工程技术领域，本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC_J2细胞系基因组中APN基因序列，建立的APN基因敲除的小肠上皮细胞可为深入揭示腹泻病原体致病机制以及抗腹泻病转基因猪的培育和应用提供更直接有效的研究模型。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9的应用技术，也涉及猪小肠上皮细胞系（IPEC_J2）模型的构建技术。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是来源于细菌和古生菌中的一种由sgRNA（small guide RNA）介导的适应性免疫系统。其中sgRNA用于识别、结合靶点DNA，当Cas9蛋白活性被激活后可结合区域下游的DNA并对其进行切割，生成双链DNA断裂，诱发由非同源末端连接修复机制造成的移码突变，从而实现对靶基因的编辑。CRISPR/Cas9技术因其简便和高效的特性，近几年来作为真核基因进行定点编辑的重要遗传手段在人类及动植物基因功能研究领域得到广泛应用。

猪小肠上皮细胞（IPEC_J2）分离自新生仔猪空肠中段的柱状上皮细胞，具有研究猪病原体感染的物种特异性，是研究猪腹泻疾病的理想体外模型，在产肠毒素大肠杆菌和病毒性腹泻抗性基因功能鉴定研究中广泛应用。氨基肽酶N基因（APN）在小肠上皮细胞中高表达，作为细胞功能性受体可介导I 型冠状病毒（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等）以及K88大肠杆菌感染宿主细胞，并且APN蛋白表达水平可决定多种病原的感染程度。

APN基因可编码多种腹泻病原感染宿主细胞的功能性受体蛋白，已有关于编辑猪APN基因的sgRNA和修饰载体（专利申请号：201710424887.0）的相关研究，然而研究人员目前尚未获得APN基因敲除的小肠上皮细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种可应用在猪腹泻疾病研究中的APN基因敲除的IPEC-J2细胞的构建方法。

本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC-J2细胞系基因组中APN基因序列。

本发明包括以下步骤：

1）将5’端添加CACCG的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列退火形成双链DNA；

2）将双链DNA与线性化后的敲除载体pGK1.1连接，得到连接产物；

3）以引物：

F：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’、

R：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，取得阳性打靶载体；

4）将阳性打靶载体转染猪小肠上皮细胞（IPEC_J2），提取细胞基因组DNA，即得APN基因敲除的IPEC-J2细胞。

本发明提供的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’中sgRNA作用位点位于猪APN基因第一外显子中。

猪腹泻病原体具有小肠亲嗜性，本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC_J2细胞系基因组中APN基因序列，建立的APN基因敲除的小肠上皮细胞可为深入揭示腹泻病原体致病机制以及抗腹泻病转基因猪的培育和应用提供更直接有效的研究模型。