[发明专利]一种三疣梭子蟹血细胞分离方法

权利要求书

1.一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，细胞分离液的制备：

1_1、配置体积摩尔浓度为0.1M的PBS缓冲溶液；

1_2、利用体积摩尔浓度为3M的氯化钠溶液调节PBS缓冲溶液的渗透压为900mOs·mol/kg，得到等渗液；

1_3、将等渗液作为稀释液，稀释体积百分浓度为60％的碘克沙醇，梯度配置体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液；

1_4、采用垫层技术，将体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液依次等量加样到离心管中，使两两之间形成分离面，形成不连续密度梯度液；

1_5、将不连续密度梯度液置于4～6℃温度环境下静置12～18小时后，形成连续密度梯度液，将该连续密度梯度液作为细胞分离液；

步骤二，三疣梭子蟹血细胞的采集：

2_1、使用抗凝剂润洗无菌注射器；

所述的步骤2_1中的抗凝剂为ACD抗凝剂；

2_2、使用润洗后的无菌注射器，从暂养的三疣梭子蟹的步足关节处抽取血淋巴液，与润洗后的无菌注射器中预留的抗凝剂1:1混匀，再将混合液置于离心管中；

2_3、在室温下对混合液进行1000～1200g离心处理2～3min后，去上清，得到细胞沉淀物；

2_4、将步骤1_2得到的等渗液作为细胞悬液，将步骤2_3得到的细胞沉淀物与细胞悬液充分混匀后得到三疣梭子蟹全血细胞悬液；

步骤三，三疣梭子蟹血细胞的分离：

3_1、取三疣梭子蟹全血细胞悬液缓慢加到细胞分离液上，其中，三疣梭子蟹全血细胞悬液与细胞分离液的体积比为1:5～4；

3_2、在4～6℃温度环境下进行2200～2400g离心处理14～16min后，三疣梭子蟹血细胞被分成三层，最上层为透明细胞层，中间层为小颗粒细胞层，最下层为大颗粒细胞层。

2.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其特征在于在所述的步骤3_2后，对分离出的透明细胞层中的透明细胞溶液、小颗粒细胞层中的小颗粒细胞溶液、大颗粒细胞层中的大颗粒细胞溶液进行细胞分离液洗涤，以保持更好的活性，具体过程为：从透明细胞层中吸取出透明细胞溶液，加入体积为吸取出的透明细胞溶液体积的3倍的等渗液，在4～6℃温度环境下进行1100～1300g离心处理2～3min后，去上清，得到沉淀物；然后在沉淀物中加入体积为沉淀物的体积的3倍的等渗液，在4～6℃温度环境下进行1100～1300g离心处理2～3min后，去上清，得到洗脱细胞分离液后的透明细胞溶液；以相同的方式，获取洗脱细胞分离液后的小颗粒细胞溶液和洗脱细胞分离液后的大颗粒细胞溶液。