[发明专利]一种三疣梭子蟹血细胞分离方法

说明书

本发明公开了一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其利用氯化钠溶液调节PBS缓冲溶液的渗透压得到的等渗液稀释碘克沙醇，梯度配置三种不同浓度的碘克沙醇液；采用垫层技术形成不连续密度梯度液，再经静置形成连续密度梯度液作为细胞分离液；采集三疣梭子蟹血细胞，以等渗液稀释后得到的混合细胞悬液作为分离对象；取混合细胞悬液缓慢加到细胞分离液上，经离心后三疣梭子蟹血细胞被分成三层，最上层为透明细胞，中间层为小颗粒细胞，最下层为大颗粒细胞；优点是只采用了一步密度梯度离心，不仅操作简单，而且通过实验发现分离出来的血细胞的活性好，可用于细胞培养。

技术领域

本发明涉及一种细胞分离技术，尤其是涉及一种三疣梭子蟹血细胞分离方法。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)俗称白蟹、枪蟹，隶属于甲壳动物亚门(Crustacea)，软甲纲(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹属(Portunus)，其广泛分布于中国、日本、朝鲜及马来西亚群岛等海域，是我国重要的海产经济蟹类。近年来三疣梭子蟹病害频发，据统计在各类病害中尤以细菌、病毒及寄生虫等病原性病害为主，给我国水产养殖业和沿海经济造成了重大损失。目前，有关海洋甲壳类先天性免疫相关的基础研究逐渐增多，以加快无脊椎动物疾病免疫防治进程。细胞分离和培养技术在研究动物免疫、疾病的致病机理以及防控中极其重要，然而该技术在海洋无脊椎动物的研究中受到了极大地限制，严重阻碍了海洋无脊椎动物免疫功能及相关机制的研究。

甲壳动物的主要免疫组织或者器官为其血淋巴和血细胞，而甲壳动物细胞免疫则主要由血细胞来承担。目前广泛认可的一个观点是：虾蟹类甲壳动物血细胞具有透明细胞、小颗粒(半颗粒)细胞和大颗粒细胞3大类。其中，透明细胞个体最小，细胞质中几乎不含有颗粒，主要参与吞噬作用；小颗粒细胞含有小的嗜酸性颗粒，并且参与早期的识别、凝固以及部分的吞噬；大颗粒细胞具有酚氧化酶原系统活性，在受到免疫刺激可以激活酚氧化酶原，同时具有细胞毒性作用。目前，有关虾类血细胞分离技术已经有了相应的研究。如：段虎等利用Percoll分离液采用两步密度梯度离心法可将红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)血细胞分离开来。又如：Dantas-Lima等人利用碘克沙醇作为细胞分离液对凡纳滨对虾的血细胞进行分离，发现要将其3种血细胞完全分离开来也同样需要两步梯度离心法。目前，国内外尚没有采用一步密度梯度离心法将3种血细胞完全分离开来的相关技术报道，国内外也尚没有开展有关蟹类血细胞分离技术的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其只需一步密度梯度离心就可将三疣梭子蟹的三种血细胞完全分离出来，且分离出来的血细胞的活性好。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，细胞分离液的制备：

1_1、配置体积摩尔浓度为0.1M的PBS缓冲溶液；

1_2、利用体积摩尔浓度为3M的氯化钠溶液调节PBS缓冲溶液的渗透压为900mOs·mol/kg，得到等渗液；

1_3、将等渗液作为稀释液，稀释体积百分浓度为60％的碘克沙醇，梯度配置体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液；

1_4、采用垫层技术，将体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液依次等量加样到离心管中，使两两之间形成分离面，形成不连续密度梯度液；

1_5、将不连续密度梯度液置于4～6℃温度环境下静置12～18小时后，形成连续密度梯度液，将该连续密度梯度液作为细胞分离液；

步骤二，三疣梭子蟹血细胞的采集：

2_1、使用抗凝剂润洗无菌注射器；