[发明专利]基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法

说明书

本发明公开了一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。该方法将植物内源油菜素内酯经过溶剂提取，提取液直接与硼亲和材料作用，内源油菜素内酯吸附于材料表面，经淋洗去除基质杂质后，再通过氧化－水解－反相洗脱的策略将吸附在硼亲和材料上的油菜素内酯洗脱而得。该方法操作简便，选择性好、回收率高，去除基质干扰彻底，可实现植物材料中痕量油菜素内酯类化合物的高灵敏度定量分析，在植物遗传学、作物科学等领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。

背景技术

油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)是一类重要的植物激素，在极低的浓度下参与调控植物的生长发育过程，包括调控花期、花粉发育、器官分化等；除了对生长发育的直接调控作用外，BRs还参与植物体对非生物、生物应激产生的应答，包括盐、干旱、极端温度等。内源BRs的准确定量分析对于研究BRs作用的分子机理具有重要的意义。但是由于BRs在植物中含量极低，并且植物基质复杂，高灵敏度BRs定量分析方法的建立一直是植物学家与分析化学家需要面对的难题。

目前，由于其良好的分离能力和较高的灵敏度，LC-MS/MS技术成为BRs定量检测最主要的手段。LC-MS/MS技术的应用使BRs检测的灵敏度得到大幅度提高，但是仍不能满足一些极端条件下的需求，如一些珍稀突变体植物的特殊部位，样品量极少，难以收集足够量的样品，因此，改进BRs样品前处理方法成为解决这一问题的最佳选择。

由于对BRs具有良好的选择性，硼亲和材料越来越多的被用于BRs的富集与纯化，硼亲和材料的应用有效地提高了前处理过程中对BRs的选择性，从而显著提高了BRs检测的灵敏度。但是，目前硼亲和材料纯化BRs的过程中通常存在以下问题：(1)需要与其他机理的固相萃取材料配合使用，一起用于BRs的除杂：如植物提取液一般需要先经过反相或者正相的固相萃取材料除杂，再与硼亲和材料作用；(2)植物提取液与硼亲和材料作用前需要除水：如植物材料冻干后提取、新鲜植物材料提取液吹干后再复溶、提取液中加入无水盐；(3)洗脱过程的回收率低：常用的洗脱体系包括酸性洗脱或者酯交换洗脱，效率较低；或者即使选择洗脱能力较强的氧化-水解体系洗脱，但是由于氧化-水解过程与洗脱过程同时进行，氧化-水解产生的硼酸残留会影响后续衍生化的效率，从而导致检测的灵敏度降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。

本发明提供的纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：

1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；

所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；

所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；

或者，

向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；

所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；

2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物。

上述方法的步骤1)中，提取溶剂为质量百分浓度为60％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为60％-100％的乙腈水溶液；所述甲醇水溶液的浓度具体可为90％；

所述油菜素内酯类化合物具体为含有邻二醇基团的油菜素内酯类化合物；

所述植物原料具体可为植物的叶片、茎、花、穗花、种子或果荚；所述植物具体可为水稻或拟南芥；