[发明专利]一种昆虫细胞的光控表达载体及应用

说明书

本发明公开了一种昆虫细胞的光控表达载体及应用，申请人基于VP‑EL222光控转录激活系统，在昆虫细胞表达载体pMIB/V5‑HisA上成功构建阳性质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP‑EL222和对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP；转染Sf9细胞后，绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激后，红色荧光蛋白表达；对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP转染Sf9细胞后，绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激，由于没有EL222转录因子，红色荧光蛋白仍然不表达。所述光控诱导表达系统首次成功运用到昆虫细胞上，拓展了该技术的应用范围。本发明所构建的验证方法质粒也为利用光控诱导表达技术提供了灵活和易用的方法。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种昆虫细胞的光控表达载体及应用。

背景技术

随着转基因技术的发展，可控的基因表达调控系统成为生物医学研究及生物技术中不可或缺的工具。过去的几十年，化学调控的基因表达系统被广泛用于从时间上调控基因的表达。但是，由于这些小分子诱导物可以自由地扩散，难以消除以及对细胞功能潜在的脱靶效应，所以很难在空间和时间上精确地控制基因的表达。然而，光是一种理想的基因表达诱导物，可控强，没有毒性，并且可以实现对目的基因表达的时间、空间双重精确控制。因此，光控基因表达系统成为了精确控制基因表达的前途光明的工具。尽管如此，当前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用，比如：蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用。在我们这里将展示一个新的光控表达系统，它没有前述的缺点，且已在哺乳动物细胞及模式动物斑马鱼中被证明广泛的适用性。该系统不仅将可为对细胞生物学、发育生物学、神经生物学等生命科学基础研究提供创新性的工具，还可广泛用于生物工程、人类疾病的诊疗等应用领域。

该光控系统是以C120DNA结合序列与EL222转录因子为基础的光调控基因表达系统(Motta-Mena et al.,2014；Rivera-Cancel,G et al.,2012)。EL222转录因子，最初源于一个细菌的光-氧-压蛋白，被蓝光照射时就会二聚化结合到C120DNA上。这个系统的光依赖转录激活作用只需少量元件，一个光敏结构域LOV，一个螺旋-转角-螺旋(H-T-H)DNA结合结构域。黑暗时LOV结构域结合着HTH结构域，覆盖了对于成为二聚体而结合到DNA所必需的HTH4α位点。蓝光照射会触发光化学反应：LOV结构域中的黄素蛋白复合物打断了LOV和HTH的相互作用，使EL222二聚化，从而发挥DNA结合蛋白活性。这些反应在黑暗中又会反过来进行，其逆反应在停止蓝光照射后将很快发生，这是快速去激活作用的基础。这个系统对控制表达的目标蛋白很大的可调表达范围，敏捷的激活和去激活作用，以及与光强度有足够高的线性相关性。总之，各项研究表明C120-EL222系统宽广的通用性以及它作为光遗传学工具的优势。

目前，以C120-EL222为基础的光控系统在哺乳动物细胞中得到了广泛的应用，在时间和空间的操控方面表现出光控系统明显的优势(Nash et al.,2011；Motta-Mena etal.,2014)。进一步，科学家尝试在斑马鱼中验证了该光控系统的可行性，虽然可以实现光控表达，但是由于表现出一定的毒性，限制了该系统在斑马鱼中的应用。接下来，通过基因工程改造，科学家优化出了更加适用于斑马鱼的光控系统，即TAEL(TA4-EL222)系统(Reade,A.et al.,2017)。C120-EL222系统从哺乳动物细胞到斑马鱼的跨越，扩展了该光控系统的应用范围，同时也为鱼类的研究提供了一个有力的工具。

基于此，申请人在Sf9昆虫细胞中建立了一个以VP-EL222为基础的光控基因表达系统，将C120-EL222光控系统的元件和荧光蛋白报告基因巧妙地整合到一个昆虫细胞表达载体上，从而使光控系统效能的测试更加快速而稳定，使昆虫细胞中外源蛋白表达的调控更加灵活。我们首次在昆虫细胞中成功实现了C120-EL222系统的光控表达，扩展了该光控系统适用范围。

发明内容