[发明专利]一种用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针及其制备方法和用途，所述球形核酸荧光探针是以金纳米粒子为载体，在所述载体的表面负载杂交双链DNA；所述杂交双链DNA中的一条DNA单链为TP‑chain长链，所述TP‑chain长链从3′端依次为端粒酶引物TP、与端粒酶扩增序列互补的序列和辅助序列；所述杂交双链DNA中的另一条DNA单链为与TP‑chain长链互补的荧光染料修饰的FL‑chain短链。本发明球形核酸荧光探针克服了肿瘤细胞的异质性，在分子水平上实现了肿瘤的普适性检测，可以实现对肿瘤从分子、细胞、组织到活体的跨平台检测和肿瘤手术的可视化导航。

技术领域

本发明涉及一种用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针及其制备方法和用途，属于分析检测和医学诊断领域。

背景技术

癌症是一种高发病率和致死率的疾病，其共性是不受控制的细胞生长。在活体条件下精确区分肿瘤细胞和正常细胞对癌症的早期诊断、治疗和预后评估有着重大的意义，但是仍然是一个长期存在的难题。目前，一系列方法如单细胞测序、分子成像、质谱分析和组织免疫化学等方法已经用来帮助解决这个困难。然而，由于肿瘤细胞的异质性和缺乏通用的肿瘤标志物，即使是同类肿瘤也可能存在几种到几十种基因型和表型，因此，这些方法不仅成本高昂且准确率不高。另一方面，这些方法缺乏通用性，不能实现从分子、细胞、组织到活体的跨平台肿瘤检测。

我们从肿瘤细胞不受控制生长这一共性出发，提出了一种普适性区分肿瘤细胞和正常细胞的方法，从而克服了肿瘤细胞异质性的限制，实现对几乎所有正常细胞和肿瘤细胞的准确区分。细胞的不受控制的生长需要激活的端粒酶来催化。端粒酶是一种逆转录酶，通过其自身的RNA模板，可以将长度为六个碱基的端粒重复序列(TTAGGG)添加到端粒的末端。端粒是染色体末端的一种特殊结构，它可以保护染色体不被降解，重排，末端融合，从而保证基因组的完整性。在正常细胞内，端粒的长度随着细胞的分裂而不断缩短，导致细胞的衰老和凋亡。然而在肿瘤细胞中，由于端粒酶被激活，端粒重复序列被补充到端粒的末端，其长度得以维持，从而导致肿瘤细胞的不受控制的生长。在生殖细胞和胚胎细胞这类快速分裂的细胞中，端粒酶活性通常也是高度表达的。因此，端粒酶被认为是一种很有价值的通用的肿瘤标志物，端粒酶活性的检测对肿瘤的诊断，治疗和预后评估具有重要的意义。自从端粒酶被发现以来，一大批检测端粒酶活性的方法被提出，经典的基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增方法(TRAP)虽然具有很高的灵敏度和检测限，但是利用细胞裂解液进行端粒酶活性检测，不仅无法提供活细胞内端粒酶活性的直接信息，而且也限制了其应用范围。

发明内容

本发明旨在提供一种用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针及其制备方法和用途。所要解决的技术问题是通过分子设计筛选出合适的探针结构从而实现对肿瘤细胞和正常细胞的精准区分。

球形核酸是一种以金纳米粒子(AuNPs)为内核，表面负载大量的高密度的DNA链的纳米粒子，它在疾病诊断、药物传递以及基因治疗方面表现出来广泛的应用前景。传统的转染试剂如脂质体、人工改造病毒等存在着高毒性、低转染效率等问题，而球形核酸在不借助任何转染试剂的帮助下，具有很高的细胞摄取率和转染效率，并且还可以保护DNA不受细胞内的核酸酶降解。金纳米粒子作为固定DNA的良好底物，可通过金-巯基共价键将DNA连接到表面上，因此AuNPs特别适合作为进入细胞的载体。

本发明球形核酸荧光探针为端粒酶敏感的荧光“关-开”结构，只有在端粒酶的作用下才会发光，实现端粒酶活性的检测。本发明球形核酸荧光探针的制备方法简单，成本较低，并可用于各种肿瘤细胞裂解液中端粒酶活性分析、活细胞成像(区分肿瘤细胞与正常细胞)、循环肿瘤细胞的流式细胞检测、各种肿瘤组织切片的鉴定、活体肿瘤荧光成像和肿瘤切除手术的可视化导航。

本发明用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针，是以金纳米粒子(AuNPs)为载体，在所述载体的表面负载杂交双链DNA。可以实现探针有效检测的负载量的范围≥60条双链DNA。