[发明专利]检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物及探针、试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物及探针、试剂盒。

背景技术

我们日常生活所食用的商品在生产、加工、包装、储存、运输、销售、烹调等各环节都存在一些非故意的污染，主要包括：生物性污染、化学性污染以及放射性污染三类。其中生物性污染发病最为迅速且具有一定的传染性。对于食源性疾病，66％以上由细菌引起的，沙门氏菌、空肠弯曲菌和单增李斯特氏菌是三种人畜共患病的病原体，传染性比较强，能够尽早发现传播源并且切断才是有效的途径。

沙门氏菌(Salmonella)是一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的革兰氏阴性杆菌，种类繁多，分布广泛。沙门氏菌病的主要是通过蛋、家禽和肉类产品传播，易感人群主要是小孩、老年人及免疫缺陷个体，能够引起肠热症、肠炎症、败血症以及慢性肠炎。空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是抗原构造与肠道杆菌一样具有o、h和k抗原的革兰氏阴性杆菌，主要寄生在多种动物如牛、羊、狗及禽类的生殖道或肠道内，通过分娩或排泄物污染食物和饮水。空肠弯曲菌在人群中普遍易感，尤其是5岁以下儿童，夏秋季多见，感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。空肠弯曲菌能够产生内毒素通过侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界，由于该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，所以冷藏食品包括肉类与奶类制品中危害最大。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。因此，在食品卫生微生物检验中，建立一种能够快速、准确并且一次能够同时检测多种致病菌的检测方法具有重要的意义。

然而，基于传统培养的方法来进行检测的，整个过程周期长，操作繁琐，还容易造成错检和漏检。基于普通PCR来进行的多重PCR检测，这种方法虽然周期大大缩短了，但由于空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌菌属比较接近，多种扩增引物同时扩增这三种菌时容易产生交叉污染，影响结果的判定。综上，目前市面上缺乏能够同时高灵敏的检测出空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种致病菌的复合荧光PCR检测用引物及探针。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够同时高灵敏检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针。

此外，还有必要提供一种同时高灵敏检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用试剂盒及其应用。

一种同时检测空肠弯曲菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的复合荧光PCR检测用引物以及探针，其特征在于，包括：

用于扩增空肠弯曲菌的上游引物mapA-F，所述上游引物mapA-F针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；

用于扩增空肠弯曲菌的下游引物mapA-R，所述下游引物mapA-R针对空肠弯曲菌的mapA基因设计；

用于检测空肠弯曲菌的探针probe-1，所述探针probe-1针对空肠弯曲菌的mapA基因设计，所述探针probe-1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团；

用于扩增沙门氏菌的上游引物fimY-F，所述上游引物fimY-F针对沙门氏菌的fimY基因设计；

用于扩增沙门氏菌的下游引物fimY-R，所述下游引物fimY-R针对沙门氏菌的fimY基因设计；

用于检测沙门氏菌的探针probe-2，所述探针probe-2针对沙门氏菌的fimY基因设计，所述探针probe-2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团；

用于扩增单增李斯特菌的上游引物hly-F，所述上游引物hly-F针对单增李斯特菌的hly基因设计；

用于扩增单增李斯特菌的下游引物hly-R，所述下游引物hly-R针对单增李斯特菌的hly基因设计；

用于检测单增李斯特菌的探针probe-3，所述探针probe-3针对单增李斯特菌的hly基因设计，所述探针probe-3的两端分别结合有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团；

所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团以及所述第三荧光报告基团各不相同。

在一个实施方式中，所述上游引物mapA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物mapA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；