[发明专利]一种鉴别梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的分子标记引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴别梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的分子标记引物及方法。

背景技术

梅芳蛇鲻隶属于辐鳍鱼纲、仙女鱼目、狗母鱼科、蛇鲻属，其外部形态与花斑蛇鲻极其相似：体长柱形，中部较粗，不柔软；眼小，具较发达脂眼睑；口大，前位，口裂长超过头长之半；上下颌前端等长，具尖锐的细牙，无钩状犬牙，颚骨每侧具2组牙；体具不易脱落之小圆鳞，胸鳍和腹鳍基部具发达腋鳞；侧线直，伸达尾鳍基，具鳞47-52枚。背鳍2个，第一背鳍具11-13鳍条，无丝状延长；第二背鳍与第一背鳍相距甚远，仅具1细小脂鳍；腹鳍与第一背鳍相对，中长，具9鳍条；臀鳍基底短于第一背鳍基底，具10-12鳍条；尾鳍叉形。体背部棕色，腹部白色，体侧具9-10黑斑，第一背鳍和尾鳍上缘具节状黑斑，各鳍乳灰色。

由于梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的外部形态非常相似，仅凭借其形态特征很难将两者区分。目前，用于鉴定梅芳蛇鲻的方法尚无正式报道。因此寻找区分梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个亟待解决的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴别梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的分子标记引物及方法，有助于解决蛇鲻属鱼类种质混杂问题，本发明方法操作简单，易于掌握，准确性高。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种鉴别梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的分子标记引物，该标记引物序列为：

MiFish-U-F：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3′；

MiFish-U-R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种鉴别北太平洋大马哈鱼和虹鳟的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)选用南海游泳动物调查采集的梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻，组成梅芳蛇鲻样本群和花斑蛇鲻样本群，提取2个样本群体的总基因组DNA；

(2)以所提取的总基因组DNA为模板进行PCR扩增反应；

(3)对成功扩增的PCR产物进行纯化、测序，比对测序结果。

优选地，所述步骤(2)中的PCR扩增反应操作方法是将17.5ul的超纯水，2.5ul的10×buffer，2ul的dNTPs，0.15ul的rTaq酶，1ul的总基因组DNA模板，1ul的Primer依次加入到0.2ml的离心管中。

优选地，所述步骤(2)中的PCR扩增程序为：94℃预变性2min，(94℃变性15sec，50℃退火15sec，72℃延伸15sec)×30个循环，72℃延伸3min，4℃保存。

本发明的有益效果是：

由梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻线粒体DNA 12S基因166bp序列比对结果，可以看出梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻序列间存在7个碱基变异位点，分别为5个转换，2个颠换，无插入/缺失。5尾梅芳蛇鲻个体的扩增结果一致，5尾花斑蛇鲻个体的扩增结果亦一致，均表现出高度的一致性。由此可以看出该方法的结果稳定，可重复性强。因此基于12S基因的碱基差异可以作为梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的种质区分的分子标记。同时，鉴别方法简单，易操作。

具体实施方式

下面通过实例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实例任何形式上的限制。

一种鉴别南海梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻的分子标记引物及方法，包括以下步骤：

(1)南海游泳动物调查采集的梅芳蛇鲻和花斑蛇鲻，组成梅芳蛇鲻样本群和花斑蛇鲻样本群，提取2个样本群体的总基因组DNA；

(2)以所提取的总基因组DNA为模板进行PCR扩增反应；

(3)对成功扩增的PCR产物进行纯化、测序，比对测序结果。

得到的分子标记引物序列为MiFish-U-F：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3′；MiFish-U-R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′。

分别取1ul的2个样本群体的总基因组DNA，并分别进行PCR扩增反应，PCR扩增反应在0.2ml的离心管中进行，操作方法具体为：在0.2ml的离心管中分别依次加入17.5ul的超纯水，2.5ul的10×buffer，2ul的dNTPs，0.15ul的rTaq酶，1ul的总基因组DNA模板，1ul的Primer。