[发明专利]一种临床级神经干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种临床级神经干细胞的制备方法，其包括：

a)通过市售人神经干细胞系，以提供单个的人神经干细胞；

b)以3×10⁵/ml至5×10⁵/ml的浓度，将所述人神经干细胞接种到常规培养瓶中维持12至24小时；

c)以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的浓度，将所述人神经干细胞转移至低吸附培养瓶，

所述低吸附培养瓶中的培养基由以下组成：DMEM/F12无血清培养基、50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、按质量/体积计10％至15％白蛋白、按质量/体积计1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/mlIGF-1；

d)每3至5天，进行半量换液；

e)每6至9天，对所述人神经干细胞进行传代；

f)收获第3至11代的人神经干细胞；

所述人神经干细胞来自选自以下的任一项：海马、大脑皮质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

所述常规培养瓶中的培养基由以下组成：DMEM/F12无血清培养基、1％至2％的B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在传代时用Accutase酶和木瓜蛋白酶消化所述人神经干细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Accutase酶和所述木瓜蛋白酶的质量比为1：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中：

步骤d)中，每4天进行半量换液。

6.根据权利要求1所述的方法，其中：

步骤e)中，每8天对所述人神经干细胞进行传代，并计数细胞数量和/或活性检测。

7.根据权利要求1所述的方法，其中：

步骤f)中，收获第4代的人神经干细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的维持是通过以下进行的：放置在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的传代是通过以下进行的：

当60％以上的所述人神经干细胞的细胞球生长至200μm至500μm时，消化所述人神经干细胞；

以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的浓度，将所述人神经干细胞接种至低吸附培养瓶中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的传代是通过以下进行的：

当80％以上的所述人神经干细胞的细胞球生长至200μm至400μm时，消化所述人神经干细胞；

以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的浓度，将所述人神经干细胞接种至低吸附培养瓶中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述海马是海马齿状回。

12.一种人神经干细胞培养基，其由以下组成：

DMEM/F12无血清培养基、

50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、

10％至15％白蛋白、

1％至2％B27、

20ng/ml至30ng/ml EGF、

20ng/ml至30ng/ml bFGF、

20ng/m至30ng/mL CNTF、

10ng/ml至20ng/ml IGF-1。

13.一种人神经干细胞培养基，其由以下组成：

DMEM/F12无血清培养基、

100ng/mL肿瘤坏死因子-α、

15％白蛋白、

2％B27、

20ng/ml EGF、

20ng/ml bFGF、

30ng/mL CNTF、

10ng/ml IGF-1。