[发明专利]一种临床级神经干细胞的制备方法

说明书

本公开提供一种临床级神经干细胞的制备方法：a)提供单个神经干细胞；b)神经干细胞接种到常规培养瓶中，此后更换为低吸附培养瓶；c)在培养基中添加肿瘤坏死因子‑α、白蛋白、B27、无动物原性细胞因子刺激神经干细胞的增殖；d)根据生长状况进行半量换液；e)根据生长状况进行消化传代；f)收获得到高纯度高活性且高分化潜能的临床级神经干细胞。本公开的方法操作简单，所得细胞纯度高且增殖能力强。通过本公开的方法制备的神经干细胞符合临床级要求。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种高效的临床级神经干细胞的制备方法。

背景技术

神经干细胞源于胚胎干细胞和成年干细胞，存在部位包括胚胎脑的端脑、小脑、海马、纹状体、大脑皮质、脑室/脑室下区、室管膜/室管膜下区、脊髓和成年脑的脑室下区、纹状体、海马齿状回、脊髓等处。

神经干细胞终身具有自我更新能力和向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞多谱系分化的潜能。它的发现和研究是神经生物学领域最重要的进展之一。

除了具有自我更新和多向分化潜能两个基本特征外，神经干细胞还存在转分化性(可塑性)、无限增殖分裂、可对称或不对称分裂、损伤或疾病状态下能刺激其增殖分化、迁移能力、低免疫原性等特征。神经干细胞能够特异性表达巢蛋白、波形蛋白、Musashil蛋白及RCI抗原。

神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病，主要表现在神经干细胞在神经发育及损伤的修复中发挥作用。植入到神经组织后，可整合入神经通路，使治疗基因的表达受到微环境调控，分化产生的神经细胞将逐渐替代有缺陷或死亡的神经细胞。因此，神经干细胞是脑卒中、脱髓鞘病、多发性硬化症等神经系统疾病基因治疗的理想载体。

神经干细胞的临床应用前景广阔。如何获得大量可增生、高活性、高分化潜能的神经干细胞是研究其生物学性质和临床应用的基础。

CN1194086C和CN1435187A公开了一种神经干细胞制剂及其制备方法，其采用分离培养的神经干细胞在体外传3至6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到神经干细胞制剂。

CN106619722A公开了一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其包括如下步骤：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；将扩增融合到80％-90％的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代，并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；将步骤种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养(包含bFGF、EGF、B27、N2添加剂、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、NAC、LIF)，待培养瓶细胞融合到80％至90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P6-P9代；将P6-P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。

CN106924286A公开了一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其包括如下步骤：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞；将P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代；取P8代细胞进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用；将工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0至4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂(Matrigel与0.4％羧甲基纤维素钠溶液)按体积比1：1进行混合。

普通的提取方法获得的神经干细胞纯度较低，培养体系不够完善，不能快速获得高增殖能力、高活性的神经干细胞，很难达到临床回输的要求。因此，本领域仍然需要寻找一种高纯度、高活性、高分化潜能的临床级神经干细胞的制备方法。

发明内容

鉴于上述需求，本申请提供了一种临床级神经干细胞的制备方法，其包括步骤：

a)提供单个神经干细胞；