[发明专利]一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法

权利要求书

1.一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株rD86H，包括结构蛋白VP2D86H；

所述结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述O型口蹄疫耐酸疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)将含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列插入到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H；所述含编码所述结构蛋白VP2D86H基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

2)将所述步骤1)得到的阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒用BglII/SpeI酶消化，将所述酶消化得到的5355bp的片段插入到用所述BglII/SpeI酶消化的pOZKF-Z1234全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H；

3)将所述步骤2)得到的全长重组质粒pOFS/VP2D86H用NotⅠ线性化处理，得到线性化DNA片段；

4)将所述步骤3)得到的线性化DNA片段转染至单层BSR/T7细胞中，转染后5h，向转染后的BSR/T7细胞中加入含8％胎牛血清的DMEM培养基培养，待转染72h后收获细胞；

5)将所述步骤4)得到的细胞经反复冻融后在BHK-21细胞上传代培养，得到O型口蹄疫耐酸疫苗毒株rD86H。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的制备方法包括以下步骤：

A.采用OZ1534(+)/OZ2152(-)和OZ2152(+)/OZ2988(-)引物对半长质粒pOZK-Z123分别进行PCR扩增，得到A片段和B片段；OZ1534(+)引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；OZ2152(-)引物具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；OZ2152(+)具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；OZ2988(-)具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

B.以A片段和B片段为模板，用OZ1534(+)/OZ2988(-)引物进行融合PCR扩增，得到融合的AB片段为含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增程序：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中转染采用Lipofectamine^TM2000介导转染。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中BSR/T7细胞的生长时期为生长至单层覆盖面积达70％～80％。

7.根据权利要求2、5或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中培养的条件：培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中反复冻融的次数为2～3次。