[发明专利]一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种主要危害猪、牛和羊等偶蹄动物的烈性传染病。该病以传播迅速、发病率高而著称，国际兽疫局(OIE)将其列为必报疫病，我国规定为一类动物传染病。

目前，全病毒灭活疫苗的免疫接种是控制FMD最有效措施。研究表明，146S FMDV粒子是灭活疫苗诱导机体产生中和抗体的最有效抗原。在所有的小RNA病毒科的病毒中，FMDV对外界环境的pH值极其敏感，尤其是O型FMDV。当环境pH值稍低于中性时，146S病毒粒子就解离为12s五聚体亚单位，从而导致灭活疫苗的有效抗原量降低，影响疫苗免疫保护效力。146S FMDV病毒粒子是由60分子的四种结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)组成的衣壳和RNA构成。其中结构蛋白上的各种氨基酸残基通过共价键、氢键、分子间力、二硫键、疏水力、非共价键等作用力缔合在一起形成病毒衣壳。当FMDV在低于中性的环境中生长时，造成氨基酸残基的主链和/或侧链所带的电荷不同，从而导致氨基酸之间的电荷作用力发生改变，从而影响五聚体内部或者五聚体之间的静电作用力，最终影响病毒衣壳的稳定性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法，使得到的疫苗毒株对酸性环境具有较好的耐受性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种O型口蹄疫耐酸疫苗毒株rD86H，包括结构蛋白VP2D86H，所述结构蛋白VP2第86位由天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)；

所述结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了所述O型口蹄疫耐酸疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)将含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列插入到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123半长质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H；含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

2)将所述步骤1)得到的阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒用BglII/SpeI酶消化，将得到的5355bp的片段插入到用所述BglII/SpeI酶消化的pOZKF-Z1234全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H；

3)将所述步骤2)得到的全长重组质粒pOFS/VP2D86H用NotⅠ线性化处理得到线性化DNA片段；

4)将所述步骤3)得到的线性化DNA片段转染至单层BSR/T7细胞中，转染后5h，向转染后的BSR/T7细胞中加入含8％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待转染72h后收获细胞；

5)将所述步骤4)得到的细胞经反复冻融后在BHK21细胞上传代培养，得到O型口蹄疫耐酸疫苗毒株rD86H。

优选的，所述步骤1)中含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的制备方法包括以下步骤：

A.采用OZ1534(+)/OZ2152(-)和OZ2152(+)/OZ2988(-)引物对分别进行PCR扩增，得到A片段和B片段；所述OZ1534(+)引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；OZ2152(-)引物具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；OZ2152(+)具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；OZ2988(-)具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

B.以A片段和B片段为模板，用OZ1534(+)/OZ2988(-)引物进行融合PCR扩增，得到融合的AB片段为含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

优选的，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增程序：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

优选的，所述步骤4)中转染采用Lipofectamine^TM 2000介导转染。

优选的，所述步骤4)中BSR/T7细胞的生长时期为生长至单层覆盖面积达70％～80％。