[发明专利]用于纯化重组ADAMTS13和其它蛋白质的方法以及其组合物

说明书

本申请是申请日为2010年8月2日、申请号为201080037078.0(PCT/EP2010/061192)、发明名称为“用于纯化重组ADAMTS13和其它蛋白质的方法以及其组合物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年7月31日提交的美国临时申请第61/230,308号的权益，其全部以引用方式并入本文，并且我们要求所述申请的优先权。

技术领域

本发明一般来说涉及纯化具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重组解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)和其它蛋白质的方法，以及包含此类纯化蛋白质的组合物。

背景技术

金属蛋白酶基因家族，ADAM(解整合素金属蛋白酶)，包括具有不同功能的膜锚定蛋白酶成员。ADAMTS家族成员与ADAM的不同之处在于C末端有一个或多个凝血酶敏感蛋白1样(TSP1)域，并且没有通常在ADAM金属蛋白酶中观察到的EGF重复序列、跨膜域和胞质尾区。

具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)是ADAMTS家族的一员。ADAMTS13具有八个凝血酶敏感蛋白域，并且没有疏水性跨膜域。因此，它被分泌。ADAMTS13裂解血管性血友病因子(von Willebrand Factor)的Tyr¹⁶⁰⁵-Met¹⁶⁰⁶键，并且需要钙和锌离子以便发挥作用。ADAMTS13也称为“血管性血友病因子-裂解蛋白酶”和“VWFCP”。

ADAMTS13表达不足已经与一些疾病，例如血栓性障碍，诸如血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病机理有牵连(参见，例如美国专利公布第20070015703号)。在TTP中，ADAMTS13的不足和/或受抑制导致整个身体的小血管中形成广泛的微观血栓(血栓性微血管病)。穿过微观血块的红细胞经受剪切应力，引起红细胞的细胞膜损伤，进而又导致血管内溶血和裂红细胞形成。血栓也引起血流量减少，从而可导致末梢器官损伤。症状通常包括神经学问题，诸如幻觉、行为怪异、精神状态改变、中风或头痛；肾功能衰竭；发烧；和导致瘀伤或紫癜的血小板减少(血小板计数低)；以及涉及贫血和黄疸的微血管溶血性贫血。目前的疗法涉及用于减少针对ADAMTS13的循环抗体的血浆除去法，和/或补充所述酶在血液中的水平。

因此，存在对提供用于纯化(特别是在商业生产规模上纯化)可用作治疗剂的重组ADAMTS13的方法的强烈需要。纯化ADAMTS13已被证明是困难的，并且已尝试包括色谱法的各种方法。结合非ADAMTS13蛋白质，而允许ADAMTS13蛋白质出现在洗脱液或上清液中的色谱材料将提供用于纯化的有用方法。结合ADAMTS13蛋白质，而使非ADAMTS13杂质留在溶液中或更加强烈地结合的色谱材料也提供引人注目的方法，并且可与其它方法一起串联使用。本公开提供此类方法。

此外，病毒污染物也在ADAMTS13蛋白质以及其它蛋白质和重组蛋白质的纯化中造成难题。一种常规方法涉及用溶液形式的溶剂-清洁剂混合物处理待纯化的样品。样品与溶剂-清洁剂化学品一起培育导致脂质包衣病毒失活。然而，这种溶液内处理不能有效要求将样品转移到至少一个其它容器以便(例如)有助于在处理后清除溶剂-清洁剂化学品。此外，一些蛋白质(包括ADAMTS13)对溶剂-清洁剂化学品敏感，导致聚集物的形成。本公开提供涉及在溶剂-清洁剂处理期间将蛋白质固定的方法以解决病毒灭活的此类问题。

发明内容