[发明专利]检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对和方法

说明书

本发明提供了检测Vero细胞基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测Vero细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示区段。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分CHO细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA，能够检测Vero细胞DNA片段大小分布。

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对和方法。

背景技术

现在，病毒类疫苗常用一些永生的细胞系，如Vero细胞来生产。这些细胞系的使用给疫苗生产提供了很多优势，如生产规模的扩大和开发速度的加快，产品质量和安全的更可控，生产成本的降低等。然而对于这些产品仍然需要关注一些安全性问题，主要是指来自宿主细胞的残留物，如残留DNA可能带来的风险，如感染性、免疫原性或致癌性等。宿主细胞残留DNA在成品中作为杂质存在。自1980s以来，国际上的主要的监管机构对于疫苗中的残留DNA的量和残留片段的大小分布等有强烈的关注。对于残留DNA的最大可承受量为10ng/剂，而对于DNA大小片段的要求则为小于一个功能基因的长度。按照现有证据表明一个功能基因最小长度为200bp，大于200bp以上的片段其潜在风险较大。因此，疫苗生产企业应该测试在成品中的残留DNA片段大小的分布情况(FDA.Guidance for industry:characterization and qualification of cell substrates and other biologicalmaterials used in the production of viral vaccines for infectious diseaseindications.February 2010)，并以合适的定量分析方法验证生产过程中对残留DNA的清除率。因为疫苗是给健康人使用的，测试分析DNA大小片段的分布对于疫苗产品来说相对是比较重要的。

常见的残留DNA的检测方法有杂交法，阈值法和qPCR法。根据技术和监管趋势，qPCR方法逐渐被各个主要监管机构所推荐和接受。基于灵敏度的考虑，针对特定的宿主细胞采用的qPCR目标序列主要为高度保守的管家基因序列，如β-actin，或者是重复序列，如鼠的L1序列，卫星序列，16S或18S rRNA基因等。

目前，所建立的qPCR方法主要是检测疫苗中残留DNA的含量，但是无法提供疫苗成品中残留DNA片段大小分布情况。目前可见报道的来分析疫苗成品中残留DNA片段分析的方法主要有毛细管电泳和qPCR方法。根据文献报道，毛细管电泳的检测范围为0.25ng/剂到250ng/剂(Xuan Shen,Xiaomu Chen,et al.Size analysis of residual host cell DNAin cell cμlture-produced vaccines by capillary gelelectrophoresis.Biologicals 41(2013)201-208)；而qPCR方法基于保守序列如18S rRNA或β-Actin设计的检测方法，其检测范围为50ng到5pg/反应(Murielle Andre,SylvianeReghin,et al.Universal real-time PCR assay for quantitation and sizeevaluation of residual cell DNA in human viral vaccines.Biologicals 44(2016)139-149)。考虑到疫苗成品制剂每剂最少为0.5ml，其对应的实际样本检测最低限为125pg/剂。而我国药典中对于Vero细胞生产的疫苗制剂的残留量为100pg/剂，上述建立的方法都无法满足实际疫苗成品样本的检测需求。

因此，本领域急需能够检测Vero细胞DNA片段大小分布的物质手段和方法。

发明内容