[发明专利]一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(1)提供嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-HER2重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞。

2.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。

3.如权利要求1或2所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述包装所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒，得到重组慢病毒包括：

将所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述重组慢病毒。

5.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，包括：

将所述Cas9的编码基因插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-cas9重组质粒，以所述pcDNA3.1-cas9重组质粒为模板进行体外转录得到Cas9mRNA；

提供靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列；将所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒为模板进行体外转录得到sgRNA；

将所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA与所述嵌合抗原受体T细胞进行混合，并置于电转仪中进行电转，完成所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因的敲除。

6.如权利要求5所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

7.如权利要求5所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的质量比为1:1-1:5。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞不包括PD1基因，所述敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞包括靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2，所述靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向HER2的单链抗体包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

10.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的或如权利要求8-9任一项所述的敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。