[发明专利]一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将嵌合抗原受体CAR‑HER2的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到靶向HER2嵌合抗原受体T细胞。所述靶向HER2嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。在临床上，人上皮生长因子受体2(human epi dermal growthfactor receptor-2，HER2)是重要的乳腺癌预后判断因子，与乳腺癌的扩散转移密切相关。HER2是人上皮生长因子受体家族的成员，HER2基因产物正常表达于分泌腺上皮细胞，当其基因拷贝异常增加，将会驱动所在细胞的恶变及扩增。据统计，乳腺癌患者中，约20～30％的患者为HER2阳性。相比HER2阴性的乳腺癌，HER2阳性的乳腺癌侵袭性强，复发、转移风险高，激素治疗和常规治疗反应差，预后不良，给患者带来沉重的打击。此外，HER2除了参与乳腺癌的发生、发展外，其还在胃癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌等多种形式的癌症中过表达。

嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。但是，CART技术目前的应用还局限于血液瘤，对于HE R2阳性实体瘤还未有相关研究。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。目前还未有敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞，所述敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性识别表面具有HER2抗原蛋白的肿瘤细胞，并激活T细胞的免疫作用对HER2阳性肿瘤细胞进行杀伤，具有更加持久细胞活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-HER2的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-HER2重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-HER2重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受体T细胞。

可选的，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。