[发明专利]一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法

权利要求书

1.一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：包括烟草基因组DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因、PCR产物的测序、克隆文库的构建测序、Blast序列比对和系统发生树的构建，具体步骤如下：

(1)取0.1g烟草叶片于预先加入液氮的研钵中充分研磨，然后转入预先加入600μLCTAB的1.5mL Eppendorf管中，涡旋振荡混匀；

(2)加入2μL巯基乙醇，混匀后放入65℃水浴30min，每隔10min振荡混匀1次；

(3)室温冷却后加入600μL氯仿，轻柔颠倒混匀，室温乳化20-30min；

(4)在室温下12000rpm离心10min后，转移上清至另一干净离心管中，加入事先在-20℃下预冷、体积为上清液2/3的异丙酮，颠倒混匀约1-2min，出现白色絮状沉淀，置于-20℃下沉淀30min；

(5)在室温下12000rpm离心1min，收集沉淀DNA，加入1mL 75％乙醇，在75％乙醇中漂洗沉淀DNA10min以上，1000rpm离心10min，吸除乙醇，置于37℃恒温箱中干燥5min；

(6)用500μL无菌水溶解沉淀DNA，向DNA粗提物中加入5μL RNA酶，轻柔混匀置于37℃条件下30min；

(7)加入体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，其中酚与上清液等体积，轻轻颠倒混匀，乳化10min，12000rpm离心10min，转移上清至1.5mL Eppendorf管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)加入与上清液等体积的异丙醇，冰浴沉淀30min，12000rpm离心1min，收集管底沉淀DNA，加入500μL 75％乙醇漂洗两次，1000rpm离心10min，吸除乙醇，置于37℃中干燥至出现半透明状；

(10)加入200μL无菌水溶解沉淀DNA，保存于-20℃备用；

(11)检测DNA的纯度和浓度；

(12)以提取的DNA为模板，以ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，PCR扩增得到的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测后按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒所提供的说明进行胶回收；

(13)对回收得到的DNA进行浓度和纯度检测，合格后进行连接转化、克隆，挑取200个克隆，对克隆获得的阳性菌株测序；

(14)将所测的序列在NCBI上进行Blast序列比对，进行系统发育分析，构建系统发生树，确定菌株的分类地位。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：所述步骤(11)中利用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：所述步骤(12)中PCR扩增ITS1-5.8S rDNA-ITS4序列反应如下：

PCR反应程序：95℃预变性15min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共运行30个循环；最后72℃延伸10min；25℃延伸10min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：所述步骤(12)中琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物所采用的电泳条件为：1％琼脂糖+25mL TBE缓冲液+3μL EB，电压120V，时间15～20min；Maker：λDNA/Hind III marker，使用前65℃预热5min，然后冰浴2min，取3μL上样；通过凝胶成像仪观察PCR产物条带并与marker比较，以判断扩增反应是否成功。