[发明专利]一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法

说明书

本发明提出了一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，包括烟草基因组DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS‑rDNA基因、PCR产物的测序、克隆文库的构建测序、Blast序列比对和系统发生树的构建。本发明提供一种快速鉴定烟草内生真菌多样性的方法，实现通过烟草DNA的提取，直接利用真菌的ITS‑rDNA基因进行扩增，节约了时间成本，突破了传统的分离鉴定方法，省去了大量菌丝样本的获得和培养，同时也可以鉴定到一些不可培养的内生真菌种类，会很大程度上提高工作效率；同时通过克隆文库的构建测序，不但可以降低实验成本，也有效的提高了烟草内生真菌多样性获得的几率，对于快速检测烟草内生真菌的种类、有目的的进行目标菌丝的分离纯化具有重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，属于微生物学领域。

背景技术

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织和器官内部或者组织间隙中的一类真菌。其与宿主植物建立了和谐的互利共生关系，是植物体微生态系统的重要组成部分。内生真菌在植物生长发育及在植物生物和非生物胁迫中发挥着重要作用，研究表明内生真菌能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性、减轻重金属对植物的不良影响等。植物内生真菌分布广泛、活性多样，已在多种植物中得到研究。此外，近年来的研究表明，生活在植物体这一特殊生态环境中的内生真菌能够与宿主发生协同进化，产生与宿主相同或相似的活性次级代谢产物，包括抑菌、抗肿瘤、促生长因子、抗氧化活性物质等，在医药、农业领域有很大的应用潜力。

烟草内生真菌是与烟草(Nicotinana tabacum)有互利共生关系的生态类群，烟草内生真菌广泛分布于烟草根、茎、叶中，具有丰富的生物多样性，是烟田微生物群落的重要成员。烟草内生真菌不仅能促进烟草生长，增强抗病虫能力，提高烟草品质和抗逆性(抗病虫害、抗重金属和抗干旱胁迫)，还具有降低烟草亚硝胺含量，改善烟叶品质的积极作用。因此，烟草内生真菌的研究及开发对阐明烟草内生真菌的种类、分布特点，提高烟叶品质具有重要意义。

现有关于植物内生真菌的文献报道主要集中在医药方向和农业方向，尤其是以生物医药开发为目标的药用植物内生真菌方面，但是存在“初步研究多，深入追究少”的特点。内生真菌的分类鉴定是研究烟草内生真菌多样性分析及种群结构特征的基础和依据，目前对烟草内生真菌研究较少，仅有一个专利涉及烟草内生真菌的分离和鉴定(一种快速分离、鉴定烟草内生真菌多样性的方法，公开号：CN105018351A)。其涉及的鉴定技术手段包括：菌丝DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的测序、序列的比对鉴定等步骤。

现有的实验技术对于大量菌丝样本的获得和培养是一个比较耗时的过程。例如不同的真菌需要的培养基和最适培养条件不同，很有可能会影响烟草内生真菌多样性的判断；即使获得大量的菌株，也需要不断的纯化培养；在纯化培养之后也需要分别提取DNA进行扩增测序鉴定；在分离鉴定阶段也是需要一定的时间。因此，在获得相关目的菌丝之前，寻找一种快速鉴定烟草内生真菌多样性的方法，从而有目的的进行目标菌丝的培养，会很大程度上提高工作效率。

发明内容

基于上述问题，本发明目的在于提供一种突破了传统的分离鉴定方法，节约时间，提高效率的鉴定烟草内生真菌多样性的方法，可以更加准确的对菌种进行分类鉴定。

针对以上问题，提供了如下技术方案：一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：包括烟草基因组DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因、PCR产物的测序、克隆文库的构建测序、Blast序列比对和系统发生树的构建，具体步骤如下：

(1)取0.1g烟草叶片于预先加入液氮的研钵中充分研磨，然后转入预先加入600μLCTAB的1.5mL Eppendorf管中，涡旋振荡混匀；

(2)加入2μL巯基乙醇，混匀后放入65℃水浴30min，每隔10min振荡混匀1次；