[发明专利]一种敲除酿酒酵母染色体的方法

权利要求书

1.一种敲除酿酒酵母染色体的方法，其特征在于，包括：

步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；

步骤2、将所述片段1-3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；

步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单倍体酿酒酵母菌株中，通过同源重组替换原有序列；然后与交配型不同得酿酒酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；

步骤4、向所述二倍体酿酒酵母菌株中转化含有vika基因的Vika质粒，通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达，Vika蛋白诱导待敲除的染色体着丝两端的vox序列重组并丢失着丝粒，完成对整条染色体的敲除。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为载体上酶切位点两端的同源臂。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒上酶切位点两端的同源臂。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒EcoRI酶切位点上游同源臂和HindIII酶切位点下游同源臂。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达为：通过Vika质粒上的乳糖操纵子序列，加入半乳糖诱导物开启Vika蛋白表达。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述Vika质粒为在商用质粒基础上，通过在多克隆位点以酶切连接的方式插入vika基因获得的质粒。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述Vika质粒为在商用质粒基础上，通过在多克隆位点以酶切连接的方式插入vika基因获得的质粒。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述商用质粒为pRS415质粒。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述商用质粒为pRS415质粒。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体着丝粒1000bp上游同源臂和1000bp下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端20bp同源序列以及在其5’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端20bp同源序列以及在其3’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段3。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述片段1的序列如SEQ ID NO:1所示。

12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：

将片段1-3形成完全互补的双链DNA，通过EcoRI和HindIII酶切和Gibson组装技术，与pUC19质粒组装，获得质粒1；EcoRI和HindIII酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4。

13.根据权利要求1-12任意一项所述方法，其特征在于，还包括在所述片段1的一端添加筛选标签。