[发明专利]一种敲除酿酒酵母染色体的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种敲除酿酒酵母染色体的方法。本发明利用Vika/vox技术切除酵母完整染色体，使染色体着丝粒通过位点特异性重组成环，从而实现整条染色体的敲除。本发明与现有通过减数分裂等方式实现整条染色体丢失的方法相比，更加简单、高效、快速地实现酿酒酵母染色体的切割：避免姐妹染色单体的交叉互换，获得染色体敲除后的酿酒酵母纯合二倍体菌株。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种敲除酿酒酵母染色体的方法。

背景技术

生物基因组携带了决定生物基本性状的遗传信息，人工DNA合成技术和DNA大片段操作技术推动了基因组人工合成研究的进步。合成生物学的发展推动了通过人工设计合成来“写”基因组信息标志着“人造生命”的开始。

基因组DNA长度过大，而且绝大多数真核生物具有多条染色体，且染色体长度都较大，涉及到染色体疾病或以染色体为单位的功能整合等都需要对整条染色体进行操作。如何实现整条染色体的敲除是一个值得探讨的问题。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，它用于制作面包和馒头等食品以及酿酒，同时还可以作为微生物发酵生产化学品的工程菌。酿酒酵母有单倍体和双倍体两种生活形态，由于双倍体酿酒酵母营养细胞大，生活能力强，工业上多用双倍体进行生产。为了能够进一步提高酿酒酵母的生产能力，需要对酵母的基因组进行改造，如果直接用二倍体改造，可能得到优良菌株是杂合的，遗传性状不稳定，而单倍体就成为一种很好地选择。通过将单倍体酵母改造为一种优良菌株，而后再通过交配重新形成优势的二倍体。

但是，酿酒酵母在形成二倍体的过程中会形成杂合二倍体。因此，对不需要的染色体及时进行敲除，能够避免这种问题的出现(单倍体酵母染色体因含有大量必需基因，无法直接敲除，必须在二倍体状态下敲除才能够存活)。此外，通过染色体的完整敲除可以实现不同单倍体来源染色体的组合，比如可以通过酵母交配和拆孢过程结合染色体敲除技术把两条合成型的染色体组合在一个单倍体细胞中。染色体完整敲除技术还可以应用于二倍体中特定表型的靶点定位(mapping)，锁定与表型关联的染色体。

在酿酒酵母中，还未发现对整条染色体的敲除技术。目前在酵母中常用的敲除技术是基因敲除技术，它是以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术，仅能对基因进行操作。现有利用减数分裂时酵母染色体染色体的不均等分配来实现染色体的丢失的方法，在减数分裂过程中，酵母的同源染色体之间会发生同源重组，不能保证单条染色体的完整性。通过这种方法要得到完整染色体的工作量大且效率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除酿酒酵母染色体的方法，使得所述方法能够提高敲除整条染色体的效率，达到80％以上的敲除率，避免姐妹染色单体交叉互换对染色体的影响，确保酿酒酵母整条染色体的敲除，获得染色体敲除后的纯合二倍体酵母。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种敲除酿酒酵母染色体的方法，包括：

步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；

步骤2、将所述片段1-3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与所述载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；

步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单倍体酿酒酵母菌株中，通过同源重组替换原有序列；然后与交配型不同得酿酒酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；