[发明专利]敲除乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法

权利要求书

1.牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一外显子上，sgRNA作用位点的碱基序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。

2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒。

3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体按以下方法构建得到：根据sgRNA作用位点的碱基序列，设计并合成编码所述sgRNA的Oligo片段，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA插入载体pCRISPR-sg5的BbsI酶切位点上，即得；

其中，所述双链DNA的序列如下：

F 5’-caccg CGATGCCATCCTGGATGCGC-3’

R 5’-aaac GCGCATCCAGGATGGCATCG c-3’。

4.权利要求1-3任一项所述打靶载体在制备NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞中的应用。

5.基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法，其特征在于，其是根据牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，以此作为ASC基因打靶载体，同时与质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase共同转入牛乳腺上皮细胞中，获得ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞；

其中，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。

6.根据权利要5所述的方法，其特征在于，所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒；将打靶载体与质粒pCRISPR-W9和pCAG-PBase共同电转化至牛乳腺上皮细胞中；

其中，用Lonza电转仪T020程序进行电转；

转化后的牛乳腺上皮细胞采用含有表皮生长因子10μg/ml，胰岛素5μg/ml和10％胎牛血清的DMEMF12培养基进行培养及传代。

7.NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞系，其特征在于，用权利要求1-3任一项所述打靶载体，同时与质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase共同转化牛乳腺上皮细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞系。

8.根据权利要7所述的细胞系，其特征在于，用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括：

引物F 5’-CCAGGTTCCTGATTTGGCTAGCTA-3’

引物R 5’-GAAGTCTCGGTCCGGAGGCCAAGG-3’。

9.权利要求7或8所述细胞系在奶牛乳腺炎病理机制研究中的应用。

10.权利要求7或8所述细胞系在奶牛乳腺炎的诊断试剂和药物筛选中的应用。