[发明专利]敲除乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。根据牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，以此作为ASC基因打靶载体，转入牛乳腺上皮细胞中，获得ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞，可作为理想的用于研究奶牛乳腺炎性损伤以及奶牛乳腺炎的细胞模型，在奶牛乳腺炎的诊断试剂和药物筛选方面发挥应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。

背景技术

乳房炎是危害奶牛业的最重要疾病，每年造成巨大的经济损失及严重的食品卫生安全问题，其中大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。奶牛乳腺上皮细胞是研究大肠杆菌性乳房炎发病机制的模型，大肠杆菌能够诱导剧烈的奶牛炎症，但具体的作用机制仍不清楚。炎性体最初于2002年在人的单核细胞提取物中发现，是由包浆内模式识别受体(PRRs)参与组装的多蛋白复合物，是先天免疫系统中的重要组成部分。炎性体在感染、炎症和自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥着极为重要的作用。炎性体主要由受体、接头蛋白及效应蛋白组成。目前已经鉴定出NLRP3、NLRP1、NLRC4和AIM2等多种炎性体受体。ASC是炎性体的接头蛋白，NLRP3受体等激活后可以招募ASC接头蛋白，进一步激活caspase-1效应蛋白，促进IL-1β及IL-18的成熟释放，调节炎症反应。除了依赖于ASC的NLRP3受体外，NLRP1及NLRC4受体可以不依赖于ASC直接激活caspase-1。大肠杆菌某些配体的炎性体已经确定，但仍有大量的受体不明确的配体能够促进caspase-1的激活。通过敲除炎性体接头蛋白ASC，不仅有利于确定大肠杆菌携带配体的炎性体受体，更为研究其他致病菌的作用机制提供了可行性。

目前，基因编辑技术飞速发展。近些年来，由CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术成为生物界获得基因敲除突变体的主流技术。该系统来源于细菌的免疫系统，其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguide RNA)，引导Cas9对DNA定点切割。通过人工合成与靶基因序列同源的sgRNA，可以直接实现对目标基因的编辑，并且这种基因的被编辑状态可以稳定遗传到下一代，无需CRISPR/Cas9外源T-DNA的持续存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一号外显子上，sgRNA作用位点的碱基序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。ASC基因Cas9结合区域示意图见图5。

用于构建所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒(图6)，由中国农业大学生命学院吴森老师馈赠，pCRISPR-sg5质粒可参见文献Xu C,Qi X,Du X,et al.piggyBacmediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2017,114(4):722-727.