[发明专利]一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用

权利要求书

1.一种耐热突变脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变获得；所述的引入多对二硫键为引入4～6对二硫键；

所述的二硫键为二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177；

所述的耐热突变脂肪酶为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s；

所述的脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：

所述的脂肪酶4s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对、五对或六对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；

（2）将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到对应的突变工程菌；

（3）将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；

（4）利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的耐热突变脂肪酶。

4.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。

5.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100 μg/mL。

6.根据权利要求3所述的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：

（5）通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度，p-NPP比色法测定15 min半失活温度，55或70℃下的半衰期，最适反应温度，最适反应pH，以及pH稳定性。