[发明专利]一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用。该耐热突变脂肪酶是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变，获得的富含多对二硫键突变的脂肪酶4s，脂肪酶5s和脂肪酶6s，其中，脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明采用迭代组合多对二硫键突变的策略，提高了脂肪酶的热稳定性，与传统引入二硫键的策略相比，通过进一步增加了引入二硫键的数目大幅度提高了中温脂肪酶的热稳定性，特别适合在工业上应用。

技术领域

本发明属于酶工程领域，特别涉及一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用。

背景技术

传统化学反应需要在高温高压的条件下进行，但催化剂价格昂贵，不易回收，且反应过程伴随大量副反应；与化学法相比，生物酶制剂催化反应条件温和、种类繁多、价格低廉。并且生物酶制剂具有底物专一性等特点，大大减少了反应生成的副产物。因此，生物酶制剂被广泛应用于工业领域。作为一类重要的生物酶制剂，耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是一种性能优良的脂肪酶，具备很高的酯化、水解和转酯化活性，目前已被广泛应用到酯水解和合成，生物柴油制备等领域。但该脂肪酶热耐热性能较差，不利于生产加工、储存和运输，是生产应用的重要瓶颈，改造其耐热性能的意义重大。

二硫键是2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。肽链上的2个半胱氨酸残基的巯基基团，可发生氧化反应形成二硫键；伴随二硫键的形成，半胱氨酸残基转变为胱氨酸残基。二硫键的形成对于保持蛋白质活性功能具有极其重要的影响，它的配对正确与否是影响蛋白质多肽链折叠的重要原因。同时，许多蛋白质需要二硫键维持其特定的高级结构。当二硫键被打断还原为巯基基团时，蛋白质结构将很可能发生改变，部分或完全失去原有的生物功能。已有大量研究通过引入二硫键的策略获得了耐热的蛋白突变体，如脂肪酶，淀粉酶和甘露聚糖酶等。但通常人为引入的二硫键数目较少，并没探究多对二硫键对蛋白质耐热性能的影响。

目前，文献中对二硫键迭代进化来提高其热稳定性的研究相对较少，因此很有必要对其进行富含二硫键的迭代进化，探讨其对热稳定性的影响。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，在耶氏解脂酵母脂肪酶2中引入多对二硫键，以提高其耐热性能，并提供3种耐热脂肪酶。

本发明的另一目的在于提供所述耐热突变脂肪酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述耐热突变脂肪酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种耐热突变脂肪酶，是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变，获得富含多对二硫键突变的耐热脂肪酶。

所述的二硫键包括二硫键S2-210(突变第2位和第210位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S8-214(突变第8位和第214位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S14-216(突变第14位和第216位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S60-69(突变第60位和第69位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)、S122-196(突变第122位和第196位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)和S118-177(突变第118位和第177位氨基酸后，两氨基酸形成的二硫键)。

所述的引入多对二硫键优选为引入4～6对二硫键。

所述的耐热突变脂肪酶优选为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s；

所述的迭代组合的方法为组合二硫键S8-214、S60-69、S122-196和S118-177(4s)，组合二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196和S118-177(5s)，或组合二硫键S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和S118-177(6s)。

所述的耐热突变脂肪酶的氨基酸序列，如下所示：