[发明专利]过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及CgGsh1基因的克隆及利用该基因在产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)中的过表达，获得2‑苯乙醇耐受性及产量均提高的产甘油假丝酵母重组菌株。方法是，利用如SEQ ID No.2和3所示的引物扩增产甘油假丝酵母基因组DNA片段，确定该扩增的DNA片段序列与酿酒酵母Gsh1基因为同源性序列，命名为CgGsh1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。利用CgGsh1基因与GAP强启动子构建了过表达重组载体pGAPa‑CgGsh1，通过化学转化法将该重组载体导入尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母中，获得重组菌株。与空载对照菌株相比，重组菌株在高浓度2‑苯乙醇(4g/L)外界环境下具有较明显的生长优势。且在发酵结束时，重组菌株的生长量提高了8.0％，2‑苯乙醇的产量提高了9.1％，达到3.6g/L。

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及产甘油假丝酵母CgGsh1基因的克隆及利用该基因在该菌株中的过表达，进而提高菌株2-苯乙醇耐受性及产量。

背景技术

2-苯乙醇，因具有淡雅、细腻而持久的玫瑰香气，广泛应用于食品、化妆品和日化用品等产业中。2-苯乙醇的化学合成法存在产物纯化困难、危害人类健康和环境安全等诸多弊端。且随着生活水平的提高和对健康的关注，各行业更倾向使用天然的2-苯乙醇。然而，天然的2-苯乙醇主要存在于玫瑰、茉莉、水仙等植物精油中，天然含量较低，提取损耗大，往往不能满足人们的需求。

目前微生物合成2-苯乙醇的途径主要有2种，莽草酸途径和艾利希途径。莽草酸途径主要以葡萄糖为底物从头合成2-苯乙醇，但由于该途径代谢支路长，存在多种反馈抑制作用等缺点，产量较低，一般仅为400-500mg/L。当在培养基中添加L-苯丙氨酸时，微生物可以直接利用L-苯丙氨酸通过艾利希途径大量合成2-苯乙醇，但由于高浓度的2-苯乙醇对菌株具有较大的毒害作用，因此产量大都低于4g/L。

谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽，它是一种细胞保护剂和信号分子。研究表明，当细胞受到外界逆境时，会直接或间接地受到代谢过程的影响而产生活性氧ROS。谷胱甘肽作为生物体内的主要抗氧化物质，能够抵抗ROS对疏基的破坏，保护细胞中的蛋白质和酶类不被氧化。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，具有高效的2-苯乙醇合成能力，及较完整的基因改造工具，为进一步分子改造菌株提高2-苯乙醇的耐受性及产量提供了有利的基础。

发明内容

本发明的目的是通过过表达谷胱甘肽合成途径中的谷氨酸半胱氨酸连接酶基因CgGsh1，提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先克隆了产甘油假丝酵母中的Gsh1同源基因，申请人将其命名为CgGsh1基因，通过在GAP强启动子控制下，在尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母中过表达CgGsh1基因，导致产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量均得到提高。具体操作步骤为：

步骤1：以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物CgGsh1F(SEQ ID No.2)和CgGsh1R(SEQ ID No.3)PCR扩增CgGsh1基因。

步骤2：利用限制性酶切位点将其插入到产甘油假丝酵母过表达重组载体pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得重组载体pGAPa-CgGsh1。该载体筛选标记为尿嘧啶合成基因Ura5(SEQ ID No.4)，整合位点为5.8s。