[发明专利]一种无缝多片段克隆的构建方法有效
| 申请号： | 201711221166.6 | 申请日： | 2017-11-29 |
| 公开（公告）号： | CN108103089B | 公开（公告）日： | 2022-08-05 |
| 发明（设计）人： | 唐国霞;施金秀;罗燕;王焕荣 | 申请（专利权）人： | 赛业（广州）生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/63 |
| 代理公司： | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 | 代理人： | 许飞 |
| 地址： | 510663 广东省广州市广州高新技术产业开发区广州科学*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 无缝 片段 克隆 构建 方法 | ||
1.一种用于多片段插入的载体，依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、负筛选基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子；Golden Gate反应位点的内切酶识别位点后补充有待剪切的多余序列，GoldenGate反应位点被剪切后得到的粘性末端不互补；Golden Gate反应位点选自内切酶BsaI、AarI、BpiI、Esp3I、LguI识别位点中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：编码抑制子为Lac Ⅰ。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：负筛选基因为ccdB。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：筛选基因为抗性筛选基因。
5.一种无缝片段克隆的构建方法，包括如下步骤：
1)设计目的DNA分子PCR引物：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物的结构为：
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序R-3’；
2)使用目的DNA分子PCR引物扩增目的基因，得到PCR产物；
3)将PCR产物与权利要求1～4任一项所述的载体混合，加入Golden Gate反应试剂，进行Golden Gate反应；
4)反应结束后，转化普通感受态细菌；
5)筛选得到无缝多片段克隆。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：目的基因的数量为1～9个。
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