[发明专利]一种无缝多片段克隆的构建方法

说明书

本发明公开了一种无缝多片段克隆的构建方法，载体依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、自杀基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。该方案具有如下优点：载体质粒无需预先经过线性化等处理，且质粒用量少，可降低质粒抽提成本；可以在同一体系中进行限制性内切酶消化反应和连接反应；每次反应均只需要一种限制性内切酶，无需考虑反应条件冲突等问题；反应中，酶切位点会被切除，无需考虑有多余片段引入是否会对目的基因产生不良影响；通过人为控制粘性末端，可避免克隆载体自连产生背景；可进行高达9个片段的无缝连接。

技术领域

本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种无缝多片段克隆的构建方法。

背景技术

基因克隆又称分子克隆，是指在大肠杆菌中将目的DNA分子片段与特定载体的DNA分子连接而产生重组质粒的方法。传统意义上，质粒重组是基于碱基互补配对的原理，一般做法为：通过引物在目的片段两端引入酶切位点；用相同的限制性内切酶分别对目的片段和质粒载体进行酶切处理；目的片段和质粒载体的酶切产物在体外连接；连接产物转化大肠杆菌；筛选重组子。后来，为满足不同的实验需求，在传统的质粒重组技术的基础上，研究者们又提出多种不同的分子克隆技术：如LIC技术、SLIC技术、Gibson组装，Gateway技术等。

LIC技术，最早由Aslanidis(Aslanicis C et al.,1990)提出，这种方法依赖于T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性。具体做法为：设计PCR扩增引物，其中目的DNA分子引物5’端12个碱基不含有dCMP，线性载体末端的5’端12个碱基不含有dGMP；利用T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性分别处理待插入的目的DNA片段和线性化载体，使其5’端分别产生粘性末端；目的DNA分子和线性化载体退火反应；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，LIC技术也是基于碱基互补配对的原理，“酶切”(外切酶反应)和“连接”反应同样是分步进行。

SLIC技术是后续研究者在LIC技术的基础上，摒弃碱基互补配对的原则而建立的不依赖于序列和连接的克隆方法(Li M Z et al.,2007)。具体做法是：设计目的DNA分子的PCR扩增引物，引物两端加上与载体同源的20～30bp的DNA片段；载体质粒线性化处理暴露出同源序列；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，该技术的“酶切”(限制性内切酶反应)和“连接”(同源重组)过程也是分步进行。

Gibson组装最早由Daniel及其同事于2009年提出，该技术适于拼接多个线性DNA片段以及进行载体组装，具体做法是：通过PCR引物在DNA分子末端加上同源片段；将DNA片段以及线性化载体在master mix(混合酶体系)作用下孵育1h；转化大肠杆菌；重组子筛选。这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；一种聚合酶，用于修补碱基的缺口；一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。从作用原理上来看，Gibson组装同样延续了传统质粒重组的碱基互补配对原则，只不过是互补序列进一步加长；该反应既需要限制性内切酶也需要限制性外切酶作用，且“酶切”(外切酶)和“连接”反应在同一个体系中完成，反应时间更短，效率更高。

Walhout最先提出Gateway技术，后经Invitrogen公司进一步趋于成熟。该技术是利用λ噬菌体的位点特异性重组原理(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶源途径之间的相互转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF(open reading fragment，开放阅读框，即基因表达序列)和插入方向。在Gateway技术中起到重组作用的是重组位点：attB，attP，attL和attR，包含两个反应，分别为BP反应和LR反应。BP反应是利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。几种质粒重组技术的对比如表1所示: