[发明专利]一种用于超声介导基因递送的壳聚糖衍生物载体制备方法

说明书

一种用于超声介导基因递送的壳聚糖衍生物载体制备方法，是通过酰化反应对低分子壳聚糖进行改性，合成了具有两亲性的正己酰壳聚糖，在此基础上加入液态氟碳，采用超声乳化方法制得由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米基因载体。本发明所制备的纳米基因载体具有超声响应能力，既可进行超声成像，又可在超声触发下增强基因转染能力，所用的高分子材料安全无毒，价格明显低于常用的合成磷脂，且制备工艺简便，操作条件温和，具有较好的潜在应用前景。

技术领域

本发明属于超声影像诊断治疗技术领域，具体是涉及一种用于超声介导基因递送的壳聚糖衍生物载体制备方法。

背景技术

近年来，随着超声分子影像技术和微泡载体制备技术的发展，超声介导靶向治疗成为研究热点。多功能超声造影剂微泡可携带基因药物经血液循环到达病变部位，并在局部超声辐照作用下定向释放基因药物，增加局部基因药物浓度；且微气泡可作为空化核降低超声空化阈值，有助于增加血管壁和细胞膜的通透性，促进细胞内吞和外源基因通过“声孔”进入细胞内。液态氟碳纳米超声造影剂具有粒径小、穿透能力好的优势，且可抵抗压力和血流冲刷作用，只有积聚在组织或细胞表面时才会表现出较强的背向散射性并通过聚集而显像。此外，与传统的微米级超声造影剂(微泡)相比，纳米级造影剂突破了传统微米级超声造影剂的粒径限制，可透过血管壁进入组织间隙和细胞内，使血管外靶组织显像成为可能，弥补了传统载基因微泡存在粒径大、基因包封率低、在体循环不稳定等缺点，更符合肿瘤靶向分子成像和治疗的要求。

壳聚糖是由一种具有良好生物相容性的天然多糖。由于其分子链中存在大量氨基且带正电荷的性质，已经成功应用于各种如核酸等生物大分子的研究。而且，壳聚糖链中氨基的高反应活性使得壳聚糖易于进行化学修饰。其中，在壳聚糖链上接枝疏水链段可使其成为两亲性壳聚糖衍生物，并通过分子自组装原理在水中形成可包裹疏水性物质的纳米胶束。

因此，可以利用该两亲性壳聚糖胶束的特点，制备包裹超疏水性液态氟碳的纳米基因载体。这一新型载体既可用于体内长循环超声成像，又可利用其表面的正电荷黏附包裹质粒DNA。其内液态氟碳在超声辐照下可发生液气相变，降低超声空化阈值，促进基因转染。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在问题和不足，提供一种包裹液态氟碳，制备工艺简便、安全低毒、价格低廉、生物相容性好的壳聚糖衍生物纳米基因载体的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明所述用于超声介导基因递送的壳聚糖衍生物载体制备方法，该载体由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成，所述壳聚糖衍生物外壳的材料为正己酰壳聚糖，其特点是包括以下步骤：

（1）合成正己酰壳聚糖；

（2）配置正己酰壳聚糖水溶液；

（3）将液态氟碳滴加到正己酰壳聚糖水溶液中，进行超声乳化处理，使液态氟碳被包裹在正己酰壳聚糖内，即得到由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米级壳聚糖衍生物载体。

其中，所述步骤（1）的具体操作方法如下：

（11）称取500mg低分子壳聚糖，将其溶解于10ml纯水后，加入10ml甲醇稀释搅拌均匀；

（12）在快速磁力搅拌下逐滴加入0.66ml的正己酸酐, 并维持转速在1000rpm的搅拌条件下反应24 h；

（13）用乙醇水溶液（25% ，v/v）透析12h，再用纯水透析36h，冷冻干燥即得到改性后的壳聚糖衍生物——正己酰壳聚糖，并通过氢核磁波谱图分析鉴定该产物。

所述步骤（2）的具体操作方法如下：

取正己酰壳聚糖20mg～50mg分散于10ml纯水中溶解。

所述步骤（3）的具体操作方法如下：