[发明专利]一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基

权利要求书

1.一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)收集人子宫内膜：从因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜，剪碎至细小组织碎片于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；

2)分离人子宫内膜上皮细胞：于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10-15min后，再加入Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7-10min后，加入血清至终浓度，得到达到终止消化的组织悬液；

3)收集子宫内膜上皮细胞：将组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；

4)培养贴壁细胞：将悬浮的细胞接种到无胶原包被的培养皿中进行培养，培养2小时，细胞贴壁成为纤维细胞，加入正常培养基继续培养；

5)收集未贴壁的细胞；收集未贴壁的细胞悬液(即为子宫内膜腺上皮细胞或细胞团块)于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清后，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；

6)获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞(P0)：将收集悬浮的未贴壁的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；

7)传代培养子宫内膜腺上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入优化培养基进行传代培养。

2.根据权利要求1所述的人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤1)中所述经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜选择卵泡期进行检查，闭经患者则动态监测卵巢卵泡变化选择排卵前期。

3.根据权利要求1所述的人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤1)中所述PBS缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。

4.根据权利要求1所述的人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2)中所述3mg/mL胶原酶IV的加入量为在无菌离心管中清洗好的组织碎片体积的3倍，且Accumax细胞分散液的加入量与3mg/mL胶原酶IV的加入量相等。

5.根据权利要求1所述的人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2)中所述加入血清的终浓度为5％。

6.根据权利要求1所述的人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤6)中所述包被有鼠尾胶原的培养皿是在培养皿中加入适量浓度为50μg/mL的I型鼠尾胶原，室温包被24h后，用PBS缓冲液清洗3次即得。

7.一种培养人子宫内膜腺上皮细胞的优化培养基，其特征在于：所述优化培养基包括DMEM培养基、F-12Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂、10mM的WNT拮抗剂。

8.根据权利要求7所述的培养人子宫内膜腺上皮细胞的优化培养基，其特征在于：所述优化培养基按体积百分比计，由如下成分配制而成：

DMEM培养基 70～75％

F-12Nutirient Mix培养基 15～30％

0.5mg/ml的氢化可的松 0.001～0.005％

胎牛血清 5％～8％

25ug/ml的表皮生长因子 0.001～0.005％

5mg/ml的胰岛素 0.05～0.2％

11.7uM的霍乱毒素 0.001～0.005

10mM的ROCK1抑制剂 0.05～0.2％

10mM的BMP4拮抗剂 0.005～0.05％

10mM的WNT拮抗剂 0.005～0.05％。