[发明专利]一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基

说明书

本发明公开一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基，该优化培养基包括DMEM培养基、F‑12 Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂、10mM的WNT拮抗剂。本发明分离培养人子宫内膜腺上皮细胞的方法，通过将胶原酶IV和Accumax细胞分散液联合消化获得的腺上皮细胞培养于本发明优化的培养基中，使分离得到的人子宫内膜腺上皮细胞传代培养至P1代呈克隆增值，可以有效地将人的子宫内膜腺上皮细胞在体外培养2代，为人子宫内膜腺上皮细胞进行体外细胞互作模型研究提供了一定量的种子细胞。

技术领域：

本发明属于原代细胞分离培养技术领域，具体涉及一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基。

背景技术：

子宫内膜上皮细胞的增殖和分化在子宫内膜损伤(创伤)修复及组织与功能稳态维持中发挥重要作用，然而目前分离与培养子宫内膜腺上皮细胞的方法、纯度及成功率相差较大，且目前的分离培养的方法不能使其进行传代培养。因此，探索有效的人子宫内膜腺上皮细胞分离培养的方法，为体外进行子宫内膜上皮细胞实验研究提供一定数量的细胞尤为重要。

目前，人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法诸多，但是一种用于高效且能进行传代培养的方法与培养基还未见有。为此，本发明提供一种优化的培养基应用在人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养中，获得一定量的子宫内膜腺上皮细胞用于后续的体外研究。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法。

本发明的另一个目的是提供一种培养人子宫内膜腺上皮细胞的优化培养基。

为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

1)收集人子宫内膜：从因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜(选择卵泡期进行检查，闭经患者则动态监测卵巢卵泡变化选择排卵前期)，剪碎至细小组织碎片于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；

步骤1)中所述PBS缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。

2)分离人子宫内膜上皮细胞：于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10-15min后，再加入Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7-10min后，加入血清至终浓度为5％，得到达到终止消化的组织悬液；

步骤2)中所述3mg/mL胶原酶IV的加入量为在无菌离心管中清洗好的组织碎片体积的3倍，且Accumax细胞分散液的加入量与3mg/mL胶原酶IV的加入量相等。

3)收集子宫内膜上皮细胞：将组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；

4)培养贴壁细胞：将悬浮的细胞接种到无胶原包被的培养皿中进行培养，培养2小时，细胞贴壁成为纤维细胞，加入正常培养基继续培养；

5)收集未贴壁的细胞；收集未贴壁的细胞悬液(即为子宫内膜腺上皮细胞或细胞团块)于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清后，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；

6)获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞(P0)：将收集悬浮的未贴壁的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；