[发明专利]热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种热启动Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述热启动Taq DNA聚合酶是经抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCRanti-Taq high，商品编号：TCP-101；

其中，所述Taq DNA聚合酶由GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1编码；

抗体修饰方法如下：

根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶；

优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建及转化：

人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和Not I双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达Taq DNA聚合酶的重组菌；

(2)重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：

①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时；

②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心10-15min，收集上清；

其中，所述预裂解缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；

所述裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；

(3)粗酶制备和纯化：

③梯度盐析：采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶，具体如下：

第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；

第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；

第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析；

④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液；

⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存；

其中，所述贮存缓冲液的配方为：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫苏糖醇，1％吐温20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；

(4)抗体修饰：

将纯化的Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动Taq DNA聚合酶；

步骤(3)中三步盐析法具体如下：

第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清转移到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液溶解，得到粗酶液；将粗酶液加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

其中，所述透析缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；

第三步盐析中用于溶解沉淀的悬浮缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；

步骤(3)中层析的具体操作如下：先用平衡缓冲液平衡色谱柱5个色谱柱柱体积，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5个色谱柱柱体积的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用5个色谱柱柱体积的浓度40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，最后用5个色谱柱柱体积的浓度60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，回收目的蛋白酶液；

其中，所述平衡缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；

所述洗脱缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；步骤(4)具体如下：

⑥将纯化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按体积比2:1混合孵育；

⑦向上述混合体系中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液，即得热启动Taq DNA聚合酶，于-20℃以下贮存；

所述酶稀释液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，0.5％吐温20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0；

步骤(4)将Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体于25℃孵育30min。

2.权利要求1所述热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high，商品编号：TCP-101；

优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建及转化：

人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和NotI双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达Taq DNA聚合酶的重组菌；

(2)重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：

①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时；

②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心10-15min，收集上清；

其中，所述预裂解缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；

所述裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；

(3)粗酶制备和纯化：

③梯度盐析：采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶，具体如下：

第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；

第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；

第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析；

④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液；

⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存；

其中，所述贮存缓冲液的配方为：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫苏糖醇，1％吐温20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；

(4)抗体修饰：

将纯化的Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动Taq DNA聚合酶；

步骤(3)中三步盐析法具体如下：

第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清转移到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液溶解，得到粗酶液；将粗酶液加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；

其中，所述透析缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；

第三步盐析中用于溶解沉淀的悬浮缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；

步骤(3)中层析的具体操作如下：先用平衡缓冲液平衡色谱柱5个色谱柱柱体积，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5个色谱柱柱体积的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用5个色谱柱柱体积的浓度40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，最后用5个色谱柱柱体积的浓度60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，回收目的蛋白酶液；

其中，所述平衡缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；

所述洗脱缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；

步骤(4)具体如下：

⑥将纯化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按体积比2:1混合孵育；

⑦向上述混合体系中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液，即得热启动Taq DNA聚合酶，于-20℃以下贮存；

所述酶稀释液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，0.5％吐温20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0；

步骤(4)将Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体于25℃孵育30min。