[发明专利]热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明的热启动Taq DNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，包括如下步骤：(1)重组表达载体的构建及转化；(2)重组菌的诱导表达；(3)粗酶制备和纯化；(4)抗体修饰。本发明提供的热启动Taq DNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。

技术领域

本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体地说，涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术

Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌中分离出的一种热稳定聚合酶，该酶基因编码区核苷酸序列为2496个碱基，编码832个氨基酸，是分子量为94KD的热稳定碱性蛋白，具有DNA结合能力。Taq DNA聚合酶良好的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的主要原因，是分子生物学中必不可少的工具酶。

在PCR第一个循环变性之前，升温过程中引物和模板会有一些非特异性配对，如果此时Taq DNA聚合酶发挥活性，则容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经后续的指数扩增，将严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。

热启动PCR技术可以用来解决非特异性扩增产物的出现，引物二聚体的形成，目标片段无扩增等问题。热启动PCR技术要通过特定的热启动DNA聚合酶来实现热启动PCR过程，热启动PCR过程中需要封闭反应体系中的组分来保证热启动PCR过程顺利进行。目前实现热启动PCR过程的方法主要包括：手工热启动法、物理隔绝法、化学封闭法及抗体修饰法等。其中手工热启动法操作步骤繁琐；物理隔绝法操作复杂，热启动效果差；化学封闭法需要预加热，易照成DNA损伤；抗体修饰法通过抗体特异性封闭酶活性中心，其中的特异性是基于抗原决定簇与抗体超变区的沟槽分子表面的结构互性与亲合性，高温加热前，抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶结合抑制了Taq DNA聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物和模板DNA引起的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增，提高了PCR扩增的特异性，该方法是目前商业化生产热启动Taq DNA聚合酶最为理想的方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种热启动Taq DNA聚合酶及其应用，该Taq DNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。

本发明的另一目的是提供上述热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，即抗体修饰法。

为了实现本发明目的，本发明提供的热启动Taq DNA聚合酶，是经抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCRanti-Taq high，商品编号：TCP-101。

本发明的热启动Taq DNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列(D32013.1)，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组工程菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析等方式，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶。

本发明中，优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。