[发明专利]一种尿液中筛查膀胱癌分子试剂

说明书

本发明属于生物技术分子诊断领域，提供了一种采用尿液无创检测膀胱癌的分子诊断方法，包括如下步骤：1.尿液核酸提取及纯化2.DNA亚硫酸氢盐转化反应及后续的纯化3.甲基化特异的实时荧光PCR检测多个基因启动子区域4.多基因结果分析。上述步骤1及2可以合并为一步。多基因包括以下基因的启动子区域：VIM、TMEFF2、HSPA2、GDF15、ABL1、CRH、IGF2、ANXA10、UPK1B、ACTB等，组合这些基因的检测结果可以用于膀胱癌的诊断并可预测其复发率。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是无创肿瘤筛查相关的分子诊断领域，方法学属于表观遗传学研究范畴，该领域达成共识：特定基因启动子区域CpG岛的甲基化状态与肿瘤发生及发展相关，包括检测、预测、预后、药物疗效、淋巴结转移等。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位。一般认为与经常接触致癌物如萘胺，联苯胺等有关，日常生活中常见的染料、橡胶、塑料制品、油漆、洗涤剂等有潜在的致癌危险，该癌症因与外界环境关系密切故被称为环境肿瘤。另外，吸烟也是膀胱癌一个独立的危险因子，膀胱癌多发于五十岁以上，男性多于女性。目前手术治疗、放疗和化疗的疗效并不令人满意，5年存活率在40％-60％。预后较差和极易复发是膀胱癌的最大特点，有效的治疗很大程度上依赖于膀胱癌的早期诊断与早期治疗。然而，膀胱癌发病隐匿，大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿才会到医院就诊，而此时已是癌症晚期。所以寻找特异的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床价值。

当前的膀胱癌的早期诊断方法有：1)尿液分析：血尿出现后首先进行尿液分析，以排除尿路炎症引起，并不能确定患者是否患膀胱癌2)尿脱落细胞分析：对尿沉渣中的脱落细胞进行镜检，可以观察区分肿瘤细胞和正常细胞。但灵敏度低，且较为主观，早期肿瘤易于漏检3)超声、CT或者MRI成像技术：对肿瘤的大小和癌病程度可以进行图像观察，尤其是近年来成像技术的不断进步，灵敏度不断提高，但对较小的肿瘤仍然不够灵敏，容易漏检4)膀胱镜：膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化观察，可以发现早期肿瘤并取样活检。该方法是一种有创性检查，不适用于膀胱癌早期筛查。目前早期诊断膀胱癌特异性最高的是膀胱镜尤其是荧光膀胱镜，但患者一般需要跟踪观察，才能有效发现肿瘤、药物疗效、复发状况等。然而，膀胱镜会对患者造成身体不适。并且荧光膀胱镜检查的荧光染料特异性不高，对人体有一定的负作用。因此，在膀胱癌的早期诊断及疗效监测预后复发方面，研究者一直在探索更特异、更灵敏的检测方法，尽可能的利用特异肿瘤标志物实现方便、快速的检测，尤其是尿液中膀胱癌标志物的检测，在临床诊断上具有重要的应用价值。目前国内尚无膀胱癌特异核酸标志物产品，只有膀胱癌特异蛋白标志物用于免疫检测，如BAT(膀胱肿瘤抗原、又称补体因子H相关蛋白，加拿大DiagnoCure的ImmunoCyt/uCyt^TM为代表)、NMP22(核基质蛋白22)、FDP(纤维蛋白降解产物)、CK19、20(细胞角蛋白19、20)、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、Cox-2(环氧化酶-2)、HAase(透明质酸酶)等蛋白检测。至今为止，国外也只有一个核酸诊断产品“The UroVysion Bladder Cancer Kit(UroVysion Kit，已被雅培收购)”,通过荧光原位杂交技术检测尿液标本，系采用3、7、17号染色体的异倍体及9p21位点的缺失观察,判断膀胱癌，为FDA认为的产品。上述的实验室诊断产品均存在灵敏度不高、特异性不强，操作繁琐，判断主观等缺点。

现有的膀胱癌分子诊断产品“The UroVysion Bladder Cancer Kit”系原位杂交显微镜检术，实验流程复杂不可标准化，判读靠肉眼偏于主观，需专业人员操作与判断。更像是实验室自制试剂用于本实验室检测，类似于技术服务而非一个可以常规应用的产品。

发明内容

针对现有技术中存在的种种弊端，本发明提供一种采用尿液无创检测膀胱癌的分子诊断方法与试剂，特点是快速、简捷、可自动化、标准化的实验室用产品。