[发明专利]香蕉冠腐病菌LAMP检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种香蕉冠腐病菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于香蕉冠腐（病菌的快速分子检测，同时可实现香蕉冠腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。

背景技术

香蕉（Musa AAA Group）为芭蕉科芭蕉属多年生单子叶草本植物，具有速生和生物量高等特点，栽培品种都是天然单性结果，一般没有种子。芭蕉属植物按果实食用性可分为三类。第一类是纤维用香蕉，又称麻蕉，果实极小，有种子，味涩不可食。第二类是供观赏的，果实细小，其蕉叶婆娑多姿、蕉花奇特美丽，如美人蕉、红花蕉等。第三类果蔬类香蕉，果实大，无种子或极个别败育种子，果肉香甜味美，可作为果品食用，或配作菜肴。这类香蕉只有香蕉（中国矮蕉、香牙蕉）和甘蕉（芭蕉、大蕉）二个种。香蕉是世界鲜果贸易量最大的水果，产量第二位，仅次于柑橘。香蕉也是栽培面积最广的水果之一。据 FAO 统计，2005 年香蕉产量达 10613万t，其中产量排名前列的国家是:印度、乌干达、巴西、厄瓜多尔、中国、菲律宾、哥伦比亚、印度尼西亚、卢旺达和加纳。近几年来，全球香蕉生产量都在稳步增长。我国南部是香蕉原产地之一，有 2000 年以上的栽培历史，现在香蕉已成为我国南亚热带地区的大宗水果，主产地在北纬 22 度附近，主要分布在广东、广西、福建、海南、云南等省（区）。此外在四川、贵州等省的南部也少量栽培。

香蕉冠腐病，主要为害香蕉果冠，使香蕉果冠变褐，后期变黑褐色、黑色。病部无明显界限，发病后从果冠逐渐向指果的端部延伸。在香蕉切口发生大量白色絮状的霉状物、毛状物，即病原菌的菌丝体和子实体，造成轴腐。延伸至果柄后，往往指果散落，果皮爆裂，失去商品价值。香蕉采收后如用聚乙烯袋包装，冠腐病发生颇为严重，运输过程中的机械伤也是该病的主要诱因之一，可造成70%-100%轴腐率，15%-30%的果腐率，已成为香蕉采后最主要的病害之一。采后香蕉的带菌检测及针对性的保鲜处理是预防香蕉冠腐病的最佳措施，因此，建立一种快速、灵敏、结果可靠、灵敏度高的检测方法用于香蕉冠腐病的早期诊断，将为病害的最佳防治时期提供技术支撑，有效减少香蕉冠腐病造成的损失。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30 min -60 min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。目前LAMP检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关香蕉冠腐病菌LAMP检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中对香蕉冠腐病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，提供了一种香蕉冠腐病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

1. 香蕉冠腐病菌LAMP检测引物的设计

根据香蕉冠腐病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉冠腐病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：

F3：5’-CAGTATTCTGGCGGGCATG-3’；

B3：5’-ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3’；

FIP: 5’-ATTTGGGGAACGCGGGTTACCGAGCGTCATTTCAACCCTCA-3’；

BIP: 5’-TCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGAAGTTGGGGTTTAACGGC-3’。

2. 建立香蕉冠腐病菌LAMP检测方法，包括以下步骤：

(1)从待检测样品中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉冠腐病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA。