[发明专利]一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒

说明书

本发明公开了一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒，以5型腺病毒基因组为基础，去除了5型腺病毒基因组距离5＇端193bp到5196bp之间的DNA序列和27893bp到30990bp之间的DNA序列；在5型腺病毒基因组距离5＇端第192个碱基和第5197个碱基之间依次插入loxp序列、腺病毒包装信号Ψ、Cre基因表达框、loxp序列；在5型腺病毒基因组距离5＇端第27892个碱基和第30991个碱基之间，插入pIX基因表达框和IVa2基因表达框。通过加入Cre基因，在包装细胞的CRE酶作用下，在去除辅助病毒包装信号Ψ的同时，诱导辅助病毒自身所携带的Cre基因的表达，提高CRE酶的量，使包装信号Ψ的去除更彻底。同时对辅助病毒的基因组结构进行调整，避免助病毒与包装细胞中的病毒基因组的重组和野生型病毒的产生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种辅助腺病毒，特别涉及一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒。

背景技术

目前在基因治疗中，将外源基因导入目标细胞最有效的手段是通过病毒载体。常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。腺相关病毒载体具有免疫原性低、不随机插入染色体等优点，但是其容量太小，在使用中受到限制。慢病毒载体由于会随机插入染色体，容易引发癌症，安全性受到质疑。腺病毒载体具有高容量、高滴度、不整合入染色体等优点，但是其免疫原性高，在体内治疗中容易引发较强的免疫反应。目前发展起来的第三代腺病毒载体将腺病毒的大部分基因组去除，只保留了其用于复制和包装的元件ITR和Ψ，从而大大降低了其免疫原性。被认为是一种很具有应用前景的病毒载体。

由于去除了大部分的病毒基因组序列，第三代腺病毒的包装需要辅助病毒来提供包装所需的各种衣壳蛋白，同时又需要避免受到辅助病毒的污染。目前常用的去除辅助病毒的方法中，效果比较好的是在其包装信号Ψ的两侧加入loxp序列，在辅助高容量腺病毒包装过程中，通过包装细胞中所表达的CRE酶作用于loxp序列后将包装信号Ψ去除，从而使得辅助病毒基因组不能够被包装。但是由于这些方法中CRE表达量不足以及在包装过程中辅助病毒与包装细胞中所包含的部分病毒基因组序列可能发生重组形成野生型病毒，因此，辅助病毒并不能从包装病毒中较好的去除，依然存在一定的污染。目前没有更好的方法使辅助病毒的污染进一步降低。

发明内容

针对上述辅助腺病毒存在污染的技术问题，本发明的目的在于，提供一种新的能够更加有效地去除包装信号并且避免产生野生型病毒的辅助腺病毒。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒，其特征在于，以5型腺病毒基因组为基础，去除了5型腺病毒基因组距离5＇端193bp到5196bp之间的DNA序列和27893bp到30990bp之间的DNA序列；在5型腺病毒基因组距离5＇端第192个碱基和第5197个碱基之间依次插入loxp序列、腺病毒包装信号Ψ、Cre基因表达框、loxp序列，插入的两个loxp序列方向保持一致；在5型腺病毒基因组距离5＇端第27892个碱基和第30991个碱基之间，插入pIX基因表达框和IVa2基因表达框。

根据本发明，所述的腺病毒包装信号Ψ是5型腺病毒的包装信号，具体为5型腺病毒基因组距离5＇端第193个碱基到第440个碱基之间的DNA序列，其方向为正向或反向。

所述的Cre基因表达框由启动子、Cre基因、终止子组成；其中，Cre基因序列包含N端序列、C端序列、内含子剪切供体序列、内含子剪切受体序列，N端序列为Cre基因编码区5＇端4个碱基到1049个碱基长的DNA片段，C端序列为Cre基因编码区3＇端4个碱基到1049个碱基长的DNA片段，在N端序列的3＇端插入一段内含子剪切供体序列，在C端序列的5＇端插入一段内含子剪切受体序列，内含子剪切供体序列和剪切受体序列总长度不超过500bp；内含子剪切供体序列、Cre基因N端序列、启动子、终止子、Cre基因C端序列、内含子剪切受体序列依次按照3＇到5＇的方向插入到腺病毒包装信号Ψ的3＇端。