[发明专利]一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基

权利要求书

1.一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；

2）消化：将步骤1）所得的子宫内膜切成1-2mm³碎块，加入消化液于37℃消化处理1-2h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；

3）原代培养：向步骤2）所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4-5×10⁴个/mL的浓度，接种于培养皿中，培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养7-10天，收取贴壁细胞，标记为P₀代细胞；

其中所述培养基为包括10%胎牛血清、8-15ng/mLEGF和8-15ng/mLPDGF-BB的DMEM-F12培养基；

所述消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/mL胶原酶I和0.2mg/mL DispaseⅡ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min-1h,然后替换消化液为含有1mg/mL透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化30min-1h；

所述步骤3）中的P₀ 代细胞包括P₀₁代细胞和P₀₂代细胞，在培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养3-4天，收取贴壁细胞并标记为P₀₁代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿中，更换培养基后继续培养4-6天，收取贴壁细胞，并标记为P₀₂代细胞；

步骤3）中，P₀₁代细胞培养过程中，更换培养基后向培养基中加入3-6ng/mLLIF和10-20mg/mL的NAC；P₀₂代细胞培养过程中，更换培养基后向培养基中加入8-18ng/mLbFGF和70-90ng/mL辅酶Q10。

2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述贴壁细胞的收取方法具体如下：将含有未贴壁细胞的培养液进行移除，然后向原培养皿中加入氯化钠注射液轻轻冲洗1-2遍，向培养皿中加入含有0.125mg/mL胰蛋白酶和0.02mg/mLEDTA的PBS缓冲液，静置1min后，显微镜观察，待镜下细胞变圆，大部分细胞脱落，向培养皿中加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清，即得待收获细胞。

3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤2）中的离心条件为1000rpm离心5min；所述步骤3）中的离心条件为1500rpm离心5min。

4.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：

4）P₁代细胞培养：将步骤3）得到的P₀₁代细胞与P₀₂代细胞分别加入氯化钠注射液进行重悬，得到单细胞悬液，然后将单细胞悬液加入到培养基中，按照4-5×10⁴个/mL的浓度，在37.0±0.5℃、5.0±0.2% CO₂浓度的饱和湿度的条件下分别单独进行培养，至细胞融合度达到85-90%，进行细胞收获，合并后得到P₁代细胞；

5）P_n代细胞培养：取P₁代细胞按照1:2-6的比例进行传代培养，传养至5代。

5.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤4）中，P₀₁代细胞传代培养过程中，向培养基中加入8-15ng/mLLIF和10-30ng/mL的TGF-β1；P₀₂代细胞传代培养过程中，向培养基中加入10-20ng/mLbFGF和40-60ng/mL辅酶Q10、8-12ng/mLTGF-α。