[发明专利]一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基

说明书

本发明涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括洗涤、消化、原代培养和传代培养步骤，其中原代培养过程中，培养3‑8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养3‑4天，然后收取贴壁细胞并标记P₀₁代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养4‑6天，收取贴壁细胞，并标记为P₀₂代细胞；在传代培养过程中，第一代采取P₀₁代细胞和P₀₂代细胞分别独立培养的方法，在第二代之后，进行混合培养。采用上述方法，得到的子宫内膜干细胞得率高、纯度高，得到的子宫内膜干细胞可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞具有高度分化的潜能。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基。

背景技术

近年来越来越多的研究表明，在子宫内膜中具有一小群具有强大增殖能力和多向分化潜能的干细胞，使子宫内膜能够保持不断的自我更新和再生能力。鉴于子宫内膜干细胞与子宫内膜生长的密切关系，可以从体外分离培养子宫内膜干细胞，然后移植于机体内，为子宫内膜损伤或病变、子宫内膜异位、不孕症、子宫内膜癌等疾病的诊断与治疗开辟新的道路。

目前国内外对于子宫内膜干细胞的研究相对较少，子宫内膜干细胞作为成体干细胞，在人体内的数量非常稀少，Smalley等发现，子宫内膜存在上皮和基质两种类型的干细胞，两种类型的细胞均可形成大克隆和小克隆。小克隆是短暂增殖细胞，其分化潜能低，排列松散，大克隆是有前体细胞起源的，具有高度分化的潜能，有小细胞紧密聚集而成。由于子宫内膜干细胞的复杂性与稀少性，严重制约了子宫内膜干细胞的研究，采用常规干细胞的分离与培养方法来体外制备子宫内膜干细胞，具有得到的细胞纯度低，干细胞数量少，具有高度分化潜能的干细胞数量更少，且传代数量少，产量低，分化严重等问题细胞，且还具有培养液成分复杂，重复性低等问题。

发明内容

本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，具体技术方案如下：

1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；

2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1-2mm³碎块，加入消化液于37℃消化处理1-2h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；

3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4-5×10⁴个/mL的浓度，接种于培养皿中，培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养7-10天，收取贴壁细胞，并标记为P₀代细胞；

其中所述培养基为包括10％胎牛血清、8-15ng/mLEGF和8-15ng/mLPDGF-BB的DMEM-F12培养基。

优选地，所述步骤3)中的P₀代细胞包括P₀₁代细胞和P₀₂代细胞，在培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养3-4天，收取铁壁细胞并标记为P₀₁代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿中，更换培养基后继续培养4-6天，收取贴壁细胞，并标记为P₀₂代细胞；

采用上述方法，得到的子宫内膜干细胞得率高、纯度高，得到的子宫内膜干细胞可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞具有高度分化的潜能。

进一步地，步骤3)中，P₀₁代细胞培养过程中，向培养基中加入3-6ng/mLLIF和10-20mg/mL的N乙酰半胱氨酸(NAC)；P₀₂代细胞培养过程中，向培养基中加入8-18ng/mLbFGF和70-90ng/mL辅酶Q10。