[发明专利]一种特异性针对溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体及其应用

说明书

本发明公开了一种特异性针对溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体及其应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑ATTTCTTACAATCTTCTTTTCACTATGTTTCTATTTCTCCATATTCCCTT‑3’(SEQ ID NO：1)或5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG‑ATTTCTTACAATCTTCTTTTCACTATGTTTCTATTTCTCCATATTCCCTT‑CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’(SEQ ID NO：2)。本发明的ssDNA核酸适配体对溶藻弧菌具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体结构稳定、易修饰，便于合成和保存，可对溶藻弧菌进行快速准确的检测和诊断。

技术领域

本发明涉及一种ssDNA核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种特异性针对溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体及其应用。

背景技术

我国作为水产养殖大国，水产养殖量占世界水产品养殖总量的70％。然而，近年来细菌性病原的暴发及流行对我国的水产养殖行业造成巨大经济损失。在广西等华南沿海地区，溶藻弧菌是引起海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一，其引起的鱼病发病迅速、死亡率高、流行面广，对着华南地区水产养殖业发展具有严重威胁。目前国际上对鱼类细菌性疾病的诊断主要采用传统观察法、免疫学检测方法、分子生物学技术等。但这些方法存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵、精确度不高等问题，不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断。

指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment technology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达10¹⁴-10¹⁵的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测水产致病菌溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断的问题。

本发明的目地在于提供一种特异性针对溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-ATTTCTTACAATCTTCTTTTCACTATGTTTCTATTTCTCCATATTCCCTT-3’(SEQ ID NO：1)。

进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-ATTTCTTACAATCTTCTTTTCACTATGTTTCTATTTCTCCATATTCCCTT-CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’(SEQ ID NO：2)。

更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。

更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、双(2,2`-联吡啶)(4,4`-二羧基-2,2`-联吡啶)钌配体中的一种或多种。

本发明的另一目地在于提供一种上述ssDNA核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：

随机文库Library50：