[发明专利]一种体外诱导抗原特异性T细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，采血：采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；

步骤二，分离：从采集到的血液中离心分离出外周淋巴细胞，再由外周血淋巴细胞分离得到原始CD4+CD45RA+T细胞；

步骤三，准备DC细胞：使用CD14标记流式分选DC细胞，并用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素-4(il-4)预处理DC细胞；

步骤四，第一次扩增T细胞：使用辐照处理的所述步骤三中的DC细胞激活T细胞；

步骤五，第二次扩增T细胞：第11天根据细胞浓度，再次加入辐照处理的DC细胞、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-15(IL-15)和转化生长因子-β(TGF-β)对所述步骤四中的T细胞重新刺激，促进T细胞的再次激活扩增，培养至细胞数达到目的扩增量，收集细胞，得到CD4+CD25+调节性T细胞。

2.根据权利要求1所述的体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于所述步骤三包括如下步骤：选用HLA表型且与所述步骤二中得到的原始CD4+CD45RA+T细胞相异的供者的血液对其经过淋巴细胞分离液分离后,分选得到CD14+细胞，并使用浓度为1000U/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),以及浓度为1000U/ml白细胞介素-4(il-4)对所述CD14+细胞刺激6天，分选得到DC细胞，在扩增之前，分选后的DC细胞加入抗原肽刺激成熟，并于诱导与扩增T细胞的当天，进行辐照当量为30Gy的辐照处理。

3.根据权利要求1所述的体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤四包括如下步骤：对所述步骤二中分选所得的所述CD4+CD45RA+T细胞进行刺激，加入所述步骤三中经辐照处理的DC细胞、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-15(IL-15)和转化生长因子-β(TGF-β)培养11天，每三天计算细胞数，并根据细胞密度分盘，补充培养基。

4.根据权利要求3所述的体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤四中，所述培养基由完全RPMI-1640培养基中添加浓度100U/ml的青霉素、浓度100μg/ml的链霉素、摩尔浓度2mM的左旋谷氨酸、摩尔浓度10mM 4-的羟乙基哌嗪乙磺酸、摩尔浓度0.1mM的非必须氨基酸、摩尔浓度1mM的丙酮酸钠和摩尔浓度50mΜ的二羟基乙醇配制而成。

5.根据权利要求1所述的体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤四中第一次扩增T细胞的方式为T细胞表面受体刺激，通过DC细胞进行T细胞表面受体刺激，调节性T细胞与DC细胞比例为10:1，由于DC细胞经过辐照处理，因此将于5天后，死亡殆尽；所述的刺激剂包括浓度为100U/ml的白细胞介素-2(IL-2)、浓度为10ng/ml的白细胞介素-5(IL-15)、浓度为100ng/ml的转化生长因子-β(TGF-β)以及摩尔浓度为10nM的雷帕霉素(rapamycin)；每三天计算细胞数，并增加培养基，从而保持细胞浓度在0.5X106/ml,同时需重新加入足量的白细胞介素-2(IL-2)，并适量加入雷帕霉素(rapamycin)以维持其浓度。

6.根据权利要求1所述的体外诱导抗原特异性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤五中第二次扩增T细胞的方式为T细胞表面受体刺激，通过DC细胞进行T细胞表面受体刺激，调节性T细胞与DC细胞比例为10:1，由于DC细胞经过辐照处理，因此将于5天后，死亡殆尽；所述的刺激剂包括浓度为100U/ml的白细胞介素-2(IL-2)、浓度为10ng/ml的白细胞介素-5(IL-15)、浓度为100ng/ml的转化生长因子-β(TGF-β)以及摩尔浓度为10nM的雷帕霉素(rapamycin)；每三天计算细胞数，并增加培养基，从而保持细胞浓度在0.5X106/ml,同时需重新加入足量的白细胞介素-2(IL-2)，并适量加入雷帕霉素(rapamycin)以维持其浓度。