[发明专利]一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)、将海水养殖鱼致病菌半数致死量浓度的菌液，灭活后加入佐剂免疫小鼠与家兔，小鼠每次免疫的灭活菌量为0.25×10⁴～0.25×10⁵，家兔免疫的灭活菌量为0.5×10⁴～0.5×10⁵，使免疫小鼠或家兔的血清抗体效价达到10^-4；

2)、分别收集小鼠与家兔的血清，使用6种兔抗病原血清混合后加入佐剂免疫产蛋鸡，产蛋鸡的免疫方法为肌肉注射，免疫量0.5ml，抗体含量为10～50μg；每隔7～10天免疫1次，共免疫3次；

3)、筛选产蛋鸡，使用间接ELISA法检测高免鸡所产鸡蛋，是否含有六种病原菌的抗独特型卵黄抗体及效价；

4)收集产蛋鸡的鸡蛋、分离卵黄、破碎去除杂蛋白，沉淀分层取上清，进一步去除脂蛋白与脂肪后获得抗独特型卵黄抗体粗品；

5)纯化抗独特型卵黄抗体粗品即得海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗；

所述海水养殖鱼致病菌为溶藻弧菌编号为ATCC 33838，鳗弧菌编号为ATCC 19106，迟缓爱德华菌编号为ATCC 23657，副溶血弧菌编号为ATCC 7802T，创伤弧菌编号为ATCC33147，链球菌编号为MCCC1A10884。

2.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中免疫小鼠与家兔的方法为腹腔注射或皮下注射，免疫次数为免疫3～4次，每次间隔7～10天。

3.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤3)产蛋鸡筛选的方法为ELISA法检测高免鸡产的蛋含有6种病原菌的抗独特型抗体，且效价均在10^-4以上。

4.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中所述破碎方法为：用高压均质机进行卵黄组织破碎，破碎后加蒸馏水搅拌均匀。

5.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中杂蛋白去除方法为将卵黄溶液的pH值调至脂蛋白的等电点，沉淀静置取上清，底部浑浊部分放入离心取上清，合并上清后微孔过滤进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为抗独特型卵黄抗体粗制品。

6.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中抗独特型抗体粗品的纯化方法为有机溶剂沉淀离心，取沉淀物；反复处理1～2次取沉淀，干燥或加适量蒸馏水使其沉淀物溶解，即得精制海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法获得的海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体或海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。